GB/T 27530-2025 牛出血性败血症诊断技术

中华人民共和国国家标准
ICS 11.220
CCS B 41
GB/T 27530—2025
牛出血性败血症诊断技术
Diagnostic techniques for bovine haemorrhagic septicaemia
2025⁃01⁃24 发布2025⁃08⁃01 实施
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会发 布
代替 GB/T 27530—2011

GB/T 27530—2025
目　　次
前言··························································································································Ⅲ
引言··························································································································Ⅳ
1　范围·······················································································································1
2　规范性引用文件········································································································1
3　术语和定义··············································································································1
4　缩略语····················································································································1
5　临床诊断·················································································································1
6　样品采集、运输与保存································································································2
7　细菌分离与镜检········································································································3
8　细菌鉴定·················································································································4
9　多重聚合酶链式反应··································································································8
10　综合判定··············································································································10
附录A（规范性）　培养基的配制······················································································11
附录B（规范性）　试剂溶液及电泳介质的配制····································································13
附录C（规范性）　多杀性巴氏杆菌分型抗原、抗血清及绵羊红细胞的制备方法···························16
附录D（资料性）　琼脂凝胶免疫扩散试验打孔及结果判定示意图············································17
附录E（资料性）　PCR 阳性对照的制备············································································18
附录F（资料性）　多杀性巴氏杆菌检测引物及扩增序列信息··················································19
附录G（资料性）　多杀性巴氏杆菌多重PCR 阳性扩增参照图················································21
参考文献····················································································································22
Ⅰ

GB/T 27530—2025
前 言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规
定起草。
本文件代替GB/T 27530—2011《牛出血性败血病诊断技术》，与GB/T 27530—2011 相比，除结构
调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：
——更改了适用范围（见第1 章，2011 年版的第1 章）；
——增加了缩略语（见第4 章）；
——更改了临床诊断特点，并增加了临床诊断的结果判定（见第5 章，2011 年版的第4 章）；
——更改了细菌分离、镜检、鉴定的操作步骤（见第7 章、第8 章，2011 年版的第5 章）；
——增加了细菌的分离培养所用培养基（见7.1、附录A）；
——更改了细菌的涂片染色镜检（见7.2、附录B，2011 年版的5.2、附录A）；
—— 删除了MR、VP 试验，β ⁃半乳糖苷酶试验，柠檬酸盐利用试验（见2011 年版的5.3.2.3.2、
5.3.2.3.4、5.3.2.3.5）；
——更改了细菌的生化特性鉴定方法，并规定了不同生化试验的培养基制备（见8.1、附录A、附录
B，2011 年版的5.3.2.3）；
——更改了间接血凝试验的荚膜抗原与抗血清制备方法（见8.2，2011 年版的5.3.2.4.1）；
——增加了荚膜型鉴定的判定标准和多杀性巴氏杆菌的多重PCR 鉴定技术（见第9 章）；
——更改了综合判定标准（见第10 章，2011 年版的第6 章）。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国农业农村部提出。
本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC 181）归口。
本文件起草单位：北京市农林科学院、中国动物卫生与流行病学中心、甘肃农业大学、福建省农业
科学院畜牧兽医研究所。
本文件主要起草人：李永清、宋翠平、刘文晓、胡永浩、秦立得、赵思俊、王玉东、傅光华、黄瑜、
曹旭敏、李木子、程龙飞、隋金钰、江波、程晶、徐福洲、周林宜、王晓茵、孙晓亮、王淑婷、刘坤、张柏铭。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：
——2011 年首次发布为GB/T 27530—2011；
——本次为第一次修订。
Ⅲ
GB/T 27530—2025
引　　言
牛出血性败血症（Bovine haemorrhagic septicaemia）是黄牛、水牛、牦牛、奶牛和野牛的一种主要疫
病，由多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）某些血清型引起，典型症状为高致死性急性败血症
和纤维素性化脓性肺炎等。本病以散发为主，偶尔呈小区域地方流行，危害较大。世界动物卫生组织
（WOAH）将牛出血性败血症列为法定名录疫病，我国将其列为三类动物疫病。
多杀性巴氏杆菌分为5 个荚膜血清型（A、B、D、E、F），各荚膜血清型之间的交叉免疫保护作用弱，
制订针对性防控措施时须首先进行血清型鉴定。
本文件的修订参考了WOAH《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2022），并结合了我国相关技术研
究新成果。
Ⅳ
GB/T 27530—2025
牛出血性败血症诊断技术
1　范围
本文件描述了牛出血性败血症的临床诊断、样品采集、运输与保存，以及多杀性巴氏杆菌的分离培
养、染色镜检、生化试验、聚合酶链式反应等实验室诊断方法。
本文件适用于牛出血性败血症的诊断。
2　规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于
本文件。
NY/T 541　兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范
3　术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4　缩略语
下列缩略语适用于本文件：
AGID：琼脂凝胶免疫扩散试验（agar gel immune diffusion test）
CIEP：对流免疫电泳试验（counter immunoelectrophoresis test）
CSY：酪蛋白⁃蔗糖⁃酵母琼脂（casein/ sucrose/ yeast agar）
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）
IHA：间接血凝试验（indirect haemagglutination test）
LPS：脂多糖（lipopolysaccharide）
PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）
Pm：多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）
RBCs：红细胞（red blood cells)
SPF： 无特定病原体（specific pathogen free）
TAE：三羟甲基氨基甲烷⁃乙酸⁃乙二胺四乙酸（Tris⁃acetic acid⁃EDTA buffer）
TSA：大豆酪蛋白琼脂（tryptic soy agar）
TSB：大豆酪蛋白液体（tryptic soy broth）
5　临床诊断
5.1　流行病学
5.1.1　患病动物、带菌动物为传染源。黄牛、水牛、牦牛、奶牛和野牛均可感染发病。
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GB/T 27530—2025
5.1.2　可通过消化道、呼吸道、皮肤或黏膜、吸血昆虫叮咬传播。
5.1.3　本病的发生一般无明显的季节性，以散发为主，偶尔呈小区域地方性流行，病程长短不一。寒
冷、闷热、潮湿、拥挤、气候剧变、阴雨连绵、圈舍通风不良、营养缺乏、饲料骤变、过度疲劳、长途运输以
及其他疾病、感染等是诱发因素。
5.2　临床症状
5.2.1　败血型
患牛病初体温高达41 ℃~42 ℃，呼吸及心跳加快，鼻镜干裂，皮温不整，食欲减退甚至废绝；病初
便秘，后腹泻，粪便始呈粥样，后为液状并混有黏液、黏膜片及血液，恶臭；有时出现鼻漏和血尿，腹泻开
始后体温下降，不久即死亡；病程极短，仅为12 h~24 h。
5.2.2　浮肿型
除呈现体温升高等一般性全身症状外，病牛颈部、咽喉部及胸前部皮下出现迅速扩展的炎性水肿，
同时伴有舌及周围组织的高度肿胀，舌多伸出齿外，呈暗红色。呼吸高度困难，皮肤和黏膜发绀，常因
窒息或下痢而死；病程较短，多为12 h~36 h。
5.2.3　肺炎型
除呈现体温升高等一般性全身症状外，病牛主要表现为纤维素性胸膜肺炎的症状；体温升高，呼吸
困难，干咳，流泡沫样鼻液，后鼻液呈脓性；胸部叩诊有痛感；病初便秘，后腹泻，粪便恶臭并混有血液；
病程较长，一般为3 d~7 d 左右。
5.3　病理变化
5.3.1　败血型
皮下、各部位黏膜、浆膜、肌肉等均有出血点，胸腹腔有大量渗出液。真胃、小肠及大肠常见出血性
炎症，肠内容物稀薄且多混有血液。淋巴结显著水肿，脾脏点状出血但不肿大。肺脏淤血、水肿。
5.3.2　浮肿型
咽喉部、颈部及肢体部皮下水肿，切开水肿部位流出深黄色透明液体，有出血，口咽周围组织及会
厌软骨韧带呈黄色胶样浸润，咽淋巴结和前颈淋巴结肿胀。上呼吸道黏膜卡他性炎症。
5.3.3　肺炎型
胸腔中有大量浆液性纤维素性渗出液，肺脏和胸膜表面有小出血点并覆有纤维素膜，肺脏切面呈
大理石状。后期，肺内有干酪样坏死灶及脓肿。心包与胸膜粘连，内有干酪样坏死物。淋巴结肿大，呈
紫色，布满出血点，尤以支气管淋巴结与纵隔淋巴结最为明显。胃肠道急性卡他性炎症和出血性炎症。
5.4　结果判定
符合上述流行病学特征并且易感动物出现上述部分或全部临床症状和病理变化时，可初步判定为
疑似牛出血性败血症。确诊应进一步采样送实验室诊断。
6　样品采集、运输与保存
6.1　样品采集
6.1.1　血液样品：按照NY/T 541 的规定采集濒死或死后30 min 内的病牛血液，每份样品不少于
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GB/T 27530—2025
2 mL。
6.1.2　组织样品：采集病死牛的肺脏、肝脏、淋巴结，取25 g~50 g 样品装入样品保存袋后封口。
6.1.3　鼻腔分泌物/体腔渗出液：采集出现体温升高、呼吸困难、流涎等典型症状的发病牛的鼻腔分泌
物或病死牛的体腔渗出液，每份样品不少于2 mL，加入样品保存管后加盖密封。
6.2　样品的运输与保存
采集的样品均置冰上冷链运输，并于24 h 内送达实验室。如果在24 h 内不能送达，应置-20 ℃冷
冻保存运输。
7　细菌分离与镜检
7.1　细菌分离
7.1.1　主要器材
7.1.1.1　培养箱（37 ℃）。
7.1.1.2　二级生物安全柜。
7.1.1.3　接菌环。
7.1.2　主要试剂
7.1.2.1　麦康凯琼脂培养基。
7.1.2.2　含5% 血清的CSY 培养基，按照附录A 中A.1 配制。
7.1.2.3　TSA 培养基，按照A.2 配制。
7.1.2.4　鲜血琼脂培养基，按照A.3 配制。
7.1.2.5　含5% 血清的TSB 培养基，按照A.4 配制。
7.1.3　操作方法
7.1.3.1　将6.1 中采集到的样品分别接种麦康凯琼脂培养基、含5% 血清的CSY 培养基或TSA 培养
基和鲜血琼脂培养基，置37 ℃条件下培养18 h~24 h 后，挑选可疑菌落进行鉴定。
7.1.3.2　当采集的样品中细菌含量少时，将样品用灭菌0.85% NaCl 溶液制成1∶10 悬液（体腔渗出液
可直接用于接种），或用含5% 血清的TSB 培养基的24 h 培养液，经皮下或腹腔接种18 g~22 g 健康
的SPF 级Balb/c 小鼠4 只~8 只，每只0.2 mL。同时取4 只~8 只清洁级小鼠注射等量0.85% NaCl
无菌溶液作为对照，隔离饲养观察。接种后48 h 内死亡的小鼠立即采集实质脏器（包括肺脏、肝脏、脾
脏）；接种后48 h 仍存活的小鼠采集心血或实质脏器，进行划线分离培养。
7.1.4　培养特性
7.1.4.1　巴氏杆菌在麦康凯琼脂培养基上不生长，在血液琼脂培养基上经18 h~24 h 后可长成圆形、光
滑、湿润、有灰白色光泽的半透明菌落，直径约1 mm，菌落周围无溶血现象。
7.1.4.2　在CSY 培养基上生成的菌落通常大于血液琼脂培养基上的菌落，在无血培养基上的老龄培
养物生成的菌落小于血液琼脂培养基上的菌落。
7.2　染色镜检
7.2.1　主要器材
7.2.1.1　显微镜。
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7.2.1.2　酒精灯。
7.2.1.3　载玻片（75 mm×25 mm）。
7.2.1.4　接菌环。
7.2.2　主要试剂
7.2.2.1　1% 结晶紫染色液，按照附录B 中B.1 配制。
7.2.2.2　革兰氏碘液，按照B.2 配制。
7.2.2.3　瑞氏染色液，按照B.3 配制。
7.2.2.4　印度墨汁染色液，按照B.4 配制。
7.2.3　操作方法
7.2.3.1　革兰氏染色
采集的组织样品或分离得到的菌落进行涂片，在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染色1 min，水
洗；滴加革兰氏碘液，作用1 min，水洗；滴加95%（体积分数）乙醇脱色，约30 s；或将95%（体积分数）
乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用95%（体积分数）乙醇滴满整个涂片，脱色10 s；水洗，滴加复染液，
复染1 min，水洗，待干。镜检，待检菌为革兰氏阴性的短杆菌，菌体大小为（0.2 μm~0.4 μm）×（0.6 μm~
2.5 μm）。
7.2.3.2　瑞氏染色
采集的组织样品或分离得到的菌落涂片自然干燥后，滴加瑞氏染色液，固定1 min；加入等量蒸馏
水，染色3 min~5 min。用蒸馏水冲洗，待干。镜检，待检菌经瑞氏染色时菌体呈两极浓染。
7.2.3.3　印度墨汁染色
接菌环挑取新鲜菌落涂片固定，滴加印度墨汁染色液1 滴，覆盖盖玻片，轻轻按压，使菌体与染色
液混合均匀。镜检，待检菌经印度墨汁染色可见明显的荚膜。
7.2.4　结果判定
慢性病例或腐败样品常不易发现典型细菌，应分离培养后再染色镜检。镜检观察到典型菌体，结
合流行特点、症状和病变，可初步确定为巴氏杆菌感染。
8　细菌鉴定
8.1　生化试验
8.1.1　主要器材
8.1.1.1　糖发酵管，按照A.5 配制。
8.1.1.2　细菌微量生化鉴定管。
8.1.2　主要试剂
8.1.2.1　尿素琼脂，按照A.6 配制。
8.1.2.2　蛋白胨水，按照A.7 配制。
8.1.2.3　硝酸盐培养基，按照A.8 配制。
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GB/T 27530—2025
8.1.2.4　柯凡克试剂，按照B.5 配制。
8.1.2.5　欧⁃波试剂，按照B.6 配制。
8.1.2.6　氧化酶试验试剂，按照B.7 配制。
8.1.2.7　硝酸盐还原试剂，按照B.8 配制。
8.1.3　操作方法
取纯培养的待检菌，应用微生物全自动鉴定系统或接种于分别添加葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘
露醇、山梨醇的糖发酵管，以及添加尿素、吲哚、氧化酶、硝酸盐（还原）、硫化氢等的细菌微量生化鉴定
管，置于37 ℃培养48 h，按细菌微量生化鉴定管说明书操作，进行相关生理生化指标测定。
8.1.4　结果判定
依据生化试验结果，能够分解葡萄糖、甘露醇、蔗糖、木糖、山梨醇产酸不产气，不能分解乳糖产酸，
吲哚试验、氧化酶试验、硝酸盐还原试验与硫化氢试验阳性，脲酶试验阴性的待检菌判为多杀性巴氏杆
菌阳性，生化反应结果按照表1。
表1　多杀性巴氏杆菌生化反应结果
菌名
多杀性
巴氏杆菌
脲酶
-
吲哚
+
氧化酶
+
硝酸盐
还原
+
硫化氢
+
发酵产酸
葡萄糖
+
乳糖
-
甘露醇
+
蔗糖
+
木糖
+
山梨醇
+
8.2　间接血凝试验
8.2.1　主要器材
8.2.1.1　血凝反应板（大孔板）。
8.2.1.2　微量可调移液器（0.1 μL~2.5 μL、0.5 μL~10 μL、10 μL~100 μL、20 μL~200 μL、100 μL~
1 000 μL）及配套滤芯吸咀。
8.2.2　主要试剂
8.2.2.1　阿氏液（Alsever’s 液），按照B.9 配制。
8.2.2.2　0.85% NaCl 溶液，按照B.10 配制。
8.2.2.3　标准菌及待检菌荚膜抗原，按照附录C 中C.1 制备。
8.2.2.4　荚膜型特异性抗血清，按照C.2 制备。
8.2.2.5　1% 新鲜绵羊红细胞，按照C.3 制备。
8.2.2.6　1% 致敏绵羊红细胞，按照C.4 制备。
8.2.3　操作程序
8.2.3.1　反应板每排第1 孔加入0.85% NaCl 溶液0.72 mL，自第2 孔起各孔分别加入0.85% NaCl 溶
液0.4 mL。
8.2.3.2　各荚膜型特异性抗血清各自单独一排稀释，第1 孔加入血清0.08 mL，混匀，吸取0.4 mL 至下
一孔，同样方法稀释至第7 孔，按图1 所示。
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图1　间接血凝试验血凝反应板加样稀释图
8.2.3.3　每孔加入0.4 mL 1% 致敏绵羊红细胞。
8.2.3.4　同时设如下对照：
——血清对照：血清（10 倍稀释）0.4 mL+1% 新鲜绵羊红细胞0.4 mL；
——绵羊红细胞对照：1% 新鲜绵羊红细胞0.4 mL+ 0.85% NaCl 溶液0.4 mL；
——抗原对照：1% 致敏绵羊红细胞0.4 mL+ 0.85% NaCl 溶液0.4 mL。
8.2.3.5　加样后，轻微振荡，置（24±1）℃，于2 h~l8 h 内判读并记录结果。
8.2.4　结果判定
绵羊红细胞沿着凹孔坡面呈絮块状凝集为巴氏杆菌阳性在孔中央形成纽扣状为巴氏杆菌阴性。
根据抗血清的种类，可鉴定待检菌的荚膜型。依据凝集范围的大小判定凝集程度为以下几级：
a） “++++” 凝集颗粒细密并均匀地分布在整个孔底，示100% 凝集，判为强阳性；
b） “+++”凝集的红细胞平铺孔底，但有卷边或缺口，示75% 凝集，判为阳性；
c） “++”红细胞呈薄层凝集，面积小，示50% 凝集，判为弱阳性；
d） “+”红细胞不完全沉于孔底，周围有散在少量凝集，示25% 凝集，判为阴性；
e）“-”红细胞沉积在孔中央，如小圆盘或纽扣状，示无凝集，判为阴性。
8.3　琼脂凝胶免疫扩散试验
8.3.1　主要器材
8.3.1.1　打孔器。
8.3.2　主要试剂
8.3.2.1　菌体抗原，按照C.5 制备。
8.3.2.2　多杀性巴氏杆菌菌体分型抗血清，1 个~16 个血清型，按照C.6 制备。
8.3.3　操作程序
8.3.3.1　琼脂凝胶平板冷凝后打孔，孔径4 mm，孔距6 mm，每组7 孔，见附录D 中图D.1。孔内琼脂
小心用针头挑出，以防破坏周围琼脂，随后用酒精灯加热封底。
8.3.3.2　中央孔加待检抗原，不同菌体型特异的抗血清加入周边孔内（以加满不溢出为度）。
8.3.3.3　加样完毕后，静置10 min，然后置带盖湿盒中，在37 ℃恒温培养箱中反应24 h~72 h，72 h 内观
察并判定结果。
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8.3.4　结果判定
将琼脂板置于暗背景的自然光下或强光照射下观察，抗原孔与抗血清孔之间出现清晰沉淀线者为
多杀性巴氏杆菌阳性，未出现沉淀线者为多杀性巴氏杆菌阴性。根据所用抗原或抗体不同，可对待检
菌进行荚膜分型或菌体抗原分型。所有能引起出血性败血症的血清型菌株均能与2 型抗血清反应，与
5 型抗血清也可能发生交叉反应。沉淀线结果判定见图D.2。
8.4　对流免疫电泳
8.4.1　主要器材
8.4.1.1　电泳仪。
8.4.2　主要试剂
8.4.2.1　对流免疫电泳介质，按照B.11 配制。
8.4.2.2　巴比妥缓冲液，按照B.12 配制。
8.4.2.3　琼脂凝胶平板，按照B.13 制备。
8.4.3　操作程序
8.4.3.1　将12 mL 电泳介质倾注玻板（57 mm×70 mm），制成琼脂凝胶平板，冷却后使用。
8.4.3.2　按照图2 所示打孔，一排7 孔，孔径4 mm，孔间距7 mm，挑去孔内琼脂，封底。另外设一排平
行组。
图2　对流免疫电泳试验抗原、抗体加样孔位置图
8.4.3.3　同一组加样孔中，阴极端的孔中加入20 μL 荚膜抗原，同时在阳极端的孔中加入等量的抗血
清。对照组分别用0.85% NaCl 溶液与阳性抗血清配对；荚膜抗原与阴性兔血清配对。
8.4.3.4　电泳槽装满巴比妥缓冲液，150 V（25 V/cm）电泳30 min，观察抗原和抗血清孔之间出现的沉
淀线。
8.4.4　结果判定
抗原和抗血清孔之间出现明显的沉淀线者判为多杀性巴氏杆菌阳性，不出现沉淀线者判为多杀性
巴氏杆菌阴性。根据抗血清的种类，可对待检菌进行多杀性巴氏杆菌的血清型鉴定。
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9　多重聚合酶链式反应
9.1　主要器材
9.1.1　PCR 扩增仪。
9.1.2　高速微型离心机。
9.1.3　微量可调移液器（0.1 μL~2.5 μL、0.5 μL~10 μL、10 μL~100 μL、20 μL~200 μL、100 μL~1 000 μL）
及配套滤芯吸咀。
9.1.4　稳压稳流电泳仪。
9.1.5　水平电泳槽。
9.1.6　凝胶成像仪。
9.2　主要试剂
9.2.1　PCR 试剂：TaqDNA 聚合酶、2.5 mmol/L 的dNTPs 预混液、10×PCR 缓冲液。也可采用商品
化的PCR 扩增试剂盒用于PCR 反应体系的制备。
9.2.2　TAE 电泳缓冲液：50×TAE，按照B.14 配制，使用前加蒸馏水配成1×TAE 缓冲液。
9.2.3　溴酚蓝缓冲液（商品化试剂）。
9.2.4　2% 琼脂糖凝胶，按照B.15 配制。
9.2.5　DNA 分子质量标准（DNA Marker）。
9.2.6　阳性对照质粒，参照附录E 制备。
9.3　引物
多杀性巴氏杆菌检测引物及扩增序列信息见附录F，检测多杀性巴氏杆菌的引物序列按照表2。
表2　鉴定多杀性巴氏杆菌种、荚膜型PCR 所用引物信息
引物特异性
所有Pm
荚膜A 型Pm
荚膜B 型Pm
荚膜D 型Pm
荚膜E 型Pm
荚膜F 型Pm
引物名
KMT1T7
KMT1SP6
RGPMA5
RGPMA6
CapB⁃F
CapB⁃R
CapD⁃F
CapD⁃R
CapE⁃F
CapE⁃R
CapF⁃F
CapF⁃R
引物序列（5′⁃3′）
ATCCGCTATTTACCCAGTGG
GCTGTAAACGAACTCGCCAC
AATGTTTGCGATAGTCCGTTAGA
ATTTGGCGCCATATCACAGTC
CATTTATCCAAGCTCCACC
GCCCGAGAGTTTCAATCC
TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC
CATCTACCCACTCAACCATATCAG
TCCGCAGAAAATTATTGACTC
GCTTGCTGCTTGATTTTGTC
AATCGGAGAACGCAGAAATCAG
TTCCGCCGTCAATTACTCTG
扩增片段大小
457 bp
564 bp
760 bp
657 bp
511 bp
851 bp
8
GB/T 27530—2025
9.4　操作程序
9.4.1　样品DNA 制备
从平板上选择单个菌落，用灭菌接种环，接种至200 μL 生理盐水中，煮沸10 min，冰上冷却3 min~
5 min，12 000 r/min 离心30 s，取2 μL 上清液作为DNA 模板用于PCR 扩增（约0.1 μg/μL），或使用商
品化的DNA 提取试剂盒提取DNA 作为模板。提取的基因组DNA，应立即进行PCR 反应或置
-20 ℃保存备用。
9.4.2　Pm 种和荚膜分型多重PCR
9.4.2.1　配制25 mL 反应体系所需试剂如下：
——2.5 μL 的10×PCR Buffer；
——5 μL 的dNTPs（2.5 mmol/L）；
——0.25 μL 的TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）；
——1 μL 的Pm 荚膜A 型/B 型/D 型/E 型/F 型的分型特异性引物F（20 μmol/L）；
——1 μL 的Pm 荚膜A 型/B 型/D 型/E 型/F 型的分型特异性引物R（20 μmol/L）；
——1 μL 的KMT1T7（20 μmol/L）；
——1 μL 的KMT1SP6（20 μmol/L）；
——100 ng 的提取样本的DNA 模板；
——补足双蒸水至25 μL。
4 000 r/min 离心20 s 后，置PCR 扩增仪内进行扩增。
9.4.2.2　设立对照。进行巴氏杆菌种属鉴定时，阳性对照以携带巴氏杆菌属鉴定靶基因质粒作为模板；
进行分型鉴定时，分别以携带5 种多杀性巴氏杆菌靶基因质粒作为模板，制备方法见附录E。阴性对
照均为不含DNA 的反应体系。
9.4.2.3　PCR 反应程序。94 ℃ 3 min 预变性；94 ℃ 变性30 s，54 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，进行
35 个循环的扩增；72 ℃ 再延伸10 min，4 ℃ 保存。在退火温度不改变的情况下，也可根据商品化的
PCR 扩增试剂盒中建议的反应程序进行扩增。
9.5　电泳
取PCR 产物10 μL 与适量溴酚蓝缓冲液混合，加样2% 琼脂糖凝胶，7 μL/孔，同时，设定2 kb
DNA ladder 标准分子质量标准，120 V 稳压电泳40 min。置于凝胶成像仪上，观察条带。
9.6　结果判定
9.6.1　试验成立条件
阳性对照出现约457 bp 扩增条带且阴性对照不出现条带，试验成立，见附录G 中图G.1。
9.6.2　判定
9.6.2.1　出现457 bp 左右的目的片段（与阳性对照大小相符），判为多杀性巴氏杆菌核酸阳性；未出现
目的片段，判为多杀性巴氏杆菌核酸阴性。
9.6.2.2　同时出现约457 bp、564 bp 共2 条扩增条带，判为荚膜A 型多杀性巴氏杆菌核酸阳性。
9.6.2.3　同时出现约457 bp、760 bp 共2 条扩增条带，判为荚膜B 型多杀性巴氏杆菌核酸阳性。
9.6.2.4　同时出现约457 bp、657 bp 共2 条扩增条带，判为荚膜D 型多杀性巴氏杆菌核酸阳性。
9.6.2.5　同时出现约457 bp、511 bp 共2 条扩增条带，判为荚膜E 型多杀性巴氏杆菌核酸阳性。
9.6.2.6　同时出现约457 bp、851 bp 共2 条扩增条带，判为荚膜F 型多杀性巴氏杆菌核酸阳性。
9
GB/T 27530—2025
10　综合判定
10.1　符合第5 章，可判为牛出血性败血症疑似病例。
10.2　疑似牛出血性败血症病例经第7 章分离的多杀性巴氏杆菌，经第8 章任一项或第9 章PCR 扩
增出457 bp 的基因片段，可判定为牛出血性败血症。
10.3　经10.2 判定为牛出血性败血症确诊病例，再经8.2 或8.3 或8.4 进行血清型鉴定或经第9 章进
行荚膜分型鉴定，可判定为某血清型或荚膜型多杀性巴氏杆菌感染；如同时出现几种血清型或荚膜型
阳性，可能为混合感染。
10
GB/T 27530—2025
附　录　A
（规范性）
培养基的配制
A.1　含5%血清的CSY 培养基
配制含5% 血清的CSY 培养基所需试剂如下：
——3 g 水解酪蛋白；
——3 g 蔗糖；
——5 g 酵母浸膏；
——5 g 氯化钠（NaCl）；
——3 g 无水磷酸氢二钾（K₂HPO₄）。
加蒸馏水至1 000 mL，完全溶解后调节pH 至7.3~7.4 后加入琼脂至其终浓度为1.5%，115 ℃高
压灭菌15 min，冷却至45 ℃~50 ℃时加入50 mL 犊牛血清并倾注平皿制成平板培养基。
A.2　TSA 培养基
向8.0 g TSA 中加入200 mL 蒸馏水，搅拌溶解，121 ℃高压20 min，冷却至50 ℃时加入无菌牛血
清混匀后倾注平皿，4 ℃保存备用。
A.3　鲜血琼脂培养基
配制鲜血琼脂培养基所需试剂如下：
——5 g 牛肉膏；
——10 g 蛋白胨；
——5 g 氯化钠（NaCl）；
——1 g 磷酸氢二钾（K₂HPO₄）；
——25 g 琼脂粉。
先将牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和磷酸氢二钾溶于蒸馏水，调节pH 至7.4~7.6，再加入琼脂粉，加入
蒸馏水定容至1 000 mL，混匀并高压灭菌后，冷却至50 ℃时加入50 mL 无菌脱纤家兔鲜血，充分混合
后倾注平皿制成平板培养基。
A.4　含5%血清的TSB 培养基
向6.0 g TSB 中加入200 mL 蒸馏水，搅拌溶解，121 ℃高压20 min，待冷却到50 ℃~60 ℃，加入
10 mL 无菌牛血清，混匀后分装至无菌试管中使用或4 ℃保存备用。
A.5　糖发酵管
配制糖发酵管所需试剂如下：
——10 g 蛋白胨；
——5.0 g 牛肉膏；
——3 g 氯化钠（NaCl）；
——2.0 g 十二水合磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）；
——12.0 mL 0.2% 溴麝香草酚蓝溶液。
各成分加热溶于1 000 mL 水中并调节pH 至7.4，按0.5% 的比例加入各种糖，分装于试管，112 ℃
高压灭菌15 min。
11
GB/T 27530—2025
A.6　尿素琼脂
配制尿素琼脂所需试剂如下：
——10 g 蛋白胨；
——5 g 氯化钠（NaCl）；
——1 g 葡萄糖（C₆H12O₆）；
——2 g 磷酸氢二钾（K₂HPO₄）；
——0.012 g 酚红；
——20 g 琼脂；
——100 mL 20% 尿素。
将除尿素以外的成分配好，并调节pH 至7.2，定容至1 000 mL，加热溶化，121 ℃高压灭菌15 min。
冷却至50 ℃~55 ℃，加入经除菌过滤的尿素溶液，混匀，制备成平板或斜面培养基。
A.7　蛋白胨水
配制蛋白胨水所需试剂如下：
——20 g 蛋白胨（或胰蛋白胨）；
——5 g 氯化钠（NaCl）。
向试剂中加入1 000 mL 蒸馏水充分溶解，分装小试管，121 ℃高压灭菌20 min。
A.8　硝酸盐培养基
配制硝酸盐培养基所需试剂如下：
——20 g 蛋白胨；
——0.2 g 硝酸钾（KNO3）。
向试剂中加入1 000 mL 蒸馏水充分溶解，调节pH 至7.4，分装试管，每管约5 mL，121 ℃高压灭
菌15 min。
12
GB/T 27530—2025
附　录　B
（规范性）
试剂溶液及电泳介质的配制
B.1　1%结晶紫染色液
配制1% 结晶紫染色液所需试剂如下：
——1 g 结晶紫；
——20 mL 95%（体积分数）乙醇（C2H5OH）；
——80 mL 1% 草酸铵水溶液［（NH4）2C2O4］。
将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
B.2　革兰氏碘液
配制革兰氏碘液所需如下试剂：
——1 g 碘（I）；
——2 g 碘化钾（KI）。
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水定容至300 mL。
B.3　瑞氏染色液
配制瑞氏染色液所需如下试剂：
——0.1 g 瑞氏色素；
——60 mL 甲醇（CH3OH）。
向甲醇中加入瑞氏色素，用乳钵研磨溶解。
B.4　印度墨汁染色液
配制印度墨汁染色液所需如下试剂：
——5 mL 印度墨汁；
——20 mL 蒸馏水。
将蒸馏水加入印度墨汁，振荡混匀。
B.5　柯凡克试剂
配制柯凡克试剂所需如下试剂：
——5 g 对二甲氨基甲醛（C9H11NO）；
——75 mL 戊醇（C5H12O）；
——25 mL 浓盐酸（HCl）。
将5 g 对二甲氨基甲醛溶解于75 mL 戊醇，然后缓慢加入浓盐酸25 mL。
B.6　欧⁃波试剂
配制欧⁃波试剂所需如下试剂：
——1 g 对二甲氨基甲醛（C9H11NO）；
——95 mL95%（体积分数）乙醇（CH3CH2OH）；
——20 mL 浓盐酸（HCl）。
13
GB/T 27530—2025
将1 g 对二甲氨基甲醛溶解于95 mL95%（体积分数）乙醇，然后缓慢加入浓盐酸20 mL。
B.7　氧化酶试验试剂
配制氧化酶试验试剂所需如下试剂：
——1 mL 蒸馏水（H2O）；
——10 g N，N⁃二甲基⁃1，4⁃苯二胺草酸盐［2（C8H12N2）·C2H2O4］。
取1 mL 蒸馏水于带密封盖离心管中，加入N，N⁃二甲基⁃1，4⁃苯二胺草酸盐约10 g，盖好密封盖，
振荡混匀，配制成氧化酶试剂。试验时现用现配。
警示：N，N⁃二甲基⁃1，4⁃苯二胺草酸盐具有毒性，有害健康。
B.8　硝酸盐还原试剂
配制硝酸盐还原试剂所需试剂如下：
——0.8 g 对氨基苯磺酸（C6H7NO3S）；
——100 mL 2.5 mol/L 乙酸溶液（CH3COOH）；
——0.5 g 甲萘胺（C10H9N）。
首先将对氨基苯磺酸0.8 g 溶解于2.5 mol/L 乙酸溶液100 mL，配制成甲液；然后将甲萘胺0.5 g
溶解于2.5 mol/L 乙酸溶液100 mL，配制成乙液。
B.9　阿氏液（Alsever’s 液）
配制阿氏液所需试剂如下：
——2.05 g 葡萄糖（C6H12O6）；
——0.80 g 柠檬酸钠（C6H5Na3O7）；
——0.055 g 柠檬酸（C6H8O7）；
——0.42 g 氯化钠（NaCl）。
试剂加蒸馏水至100 mL，混合过滤，调节pH 至6.8，115 ℃灭菌10 min，4 ℃保存备用。
B.10　0.85% NaCl 溶液
将0.85 g 氯化钠（NaCl）加入90 mL 去离子水中，充分溶解，加蒸馏水将溶液定容至100 mL，
121 ℃灭菌30 min，保存于4 ℃。
B.11　对流免疫电泳介质
配制对流免疫电泳介质所需试剂如下：
——2.0 g 琼脂糖；
——2.06 g 巴比妥钠（C8H12N2O3）；
——0.37 g 二乙基巴比妥酸（C8H12N2O3）。
用180 mL 蒸馏水完全溶解上述混合物，然后加入0.01% 硫柳汞20 mL。
B.12　巴比妥醋酸盐缓冲液（巴比妥缓冲液）
配制巴比妥醋酸盐缓冲液所需试剂如下：
——29.24 g 巴比妥钠（C8H12N2O3）；
——11.70 g 无水醋酸钠（C2H3NaO2）；
——180 mL 0.1 mol/L 盐酸（HCl）。
用蒸馏水充分溶解，调节pH 至8.8，加蒸馏水至3 L。
14
GB/T 27530—2025
B.13　琼脂凝胶平板
取0.9 g 优质琼脂加入90 mL 0.85% NaCl 溶液中，加热溶化后再加入1% 硫柳汞溶液1 mL，最后
加入适量0.85% NaCl 溶液定容至100 mL。冷却至45 ℃~50 ℃，倾注水平放置的洁净载玻片、玻璃片
或平皿（凝胶厚度为2.5 mm~3 mm）。
B.14　TAE 电泳缓冲液（50×TAE）
配制TAE 电泳缓冲液（50×TAE）所需试剂如下：
——242 g 三羟甲基甲烷碱（Tris base）；
——57.1 mL 冰乙酸（CH3COOH）；
——100 mL 0.5 mol/L（pH8.0）乙二胺四乙酸（EDTA）。
将试剂完全溶解后，加蒸馏水至1 000 mL，置4 ℃冰箱中备用。如配制2% 的琼脂糖凝胶和用作
电泳缓冲液时，用蒸馏水稀释50 倍即为1×TAE 缓冲液。
B.15　2%琼脂糖凝胶
取2 g 琼脂糖加入至100 mL 1× TAE 缓冲液中，在微波炉中充分溶解后，冷却至50 ℃~60 ℃，加
入5 μL（10 mg/mL）溴乙锭（或相当的其他核酸染料），混匀后倒入凝胶板（凝胶的厚度为4 mm）；在距
离底板0.5 mm 的位置放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔；待凝胶完全凝固后，小心
移去梳子；将凝胶板放入电泳槽中，加入恰好没过胶面约1 mm 深的足量电泳缓冲液。
B.16　1%硫柳汞溶液
1 g 硫柳汞（C9H9HgNaO2S）溶解于100 mL 蒸馏水后，置于100 mL 瓶中盖塞，室温保存。
15
GB/T 27530—2025
附　录　C
（规范性）
多杀性巴氏杆菌分型抗原、抗血清及绵羊红细胞的制备方法
C.1　荚膜抗原制备
取培养6 h~8 h 的参考菌株（待检菌株）肉汤培养物1 mL 均匀涂布至CSY 血液琼脂平板上（直径
90 mm），37 ℃培养过夜。用3 mL 0.85% NaCl 溶液洗下生长物，56 ℃加热30 min，4 ℃ 3 000 g 离心
15 min，收集上清液保存于-20 ℃备用。若没有冷冻离心机，则1 500 g 离心30 min，取上清液作为抗
原提取物。
C.2　不同荚膜型特异性抗血清的制备和处理
C.2.1　制备
将荚膜A、B、D、E、F 型标准菌株分别接种于CSY 血液琼脂平板上，37 ℃ 培养18 h~20 h，用
3 mL 生理盐水洗下生长物，菌体悬液浊度调至与布朗氏比浊管的第4 管相同。每隔3 d~4 d，家兔静
脉接种悬液一次，注射量分别为0.2 mL、0.5 mL、l.0 mL、1.5 mL 及2.0 mL。最后一次注射后1 周，取
0.5 mL 相同的活菌悬液，皮下或肌肉接种。10 d 后采血收集血清，保存于-20 ℃，而常用的少量血清
可加入硫柳汞至0.01%，4 ℃保存。
C.2.2　处理
用前将1 份压积绵羊红细胞加入3 份型特异性抗血清中，（24±1） ℃ 作用30 min，500 g 离心
10 min，去除绵羊红细胞，处理的抗血清经56 ℃灭活30 min。
C.3　1%新鲜绵羊红细胞的制备
按照1∶1 的比例将阿氏液加入抗凝的绵羊血，经玻璃珠脱纤后加入6 倍~8 倍体积的0.85% NaCl
溶液洗涤，500 g 离心收集绵羊红细胞，重复3 次，最后一次收集的绵羊红细胞，应恢复到原血量的
一半。取2 mL 绵羊红细胞，加入98 mL 0.85% NaCl 溶液，即1% 新鲜绵羊红细胞悬液。4 ℃保存，2 d
内使用。
C.4　致敏绵羊红细胞的制备
取3 mL 荚膜抗原加入0.2 mL 新鲜制备的绵羊红细胞，充分混匀，37 ℃振荡2 h，离心去上清液，
用10 mL 0.85% NaCl 溶液洗涤一次，离心悬浮于20 mL 0.85% NaCl 溶液，即1% 致敏绵羊红细胞
悬液。
C.5　菌体抗原制备
将细菌接种血液琼脂平板培养24 h 后，用1 mL 8.5% NaCl 溶液冲洗并收获生长物。置悬浮液于
100 ℃水浴中加热1 h，离心弃沉淀，取上清液即为琼脂凝胶免疫扩散试验抗原。
C.6　菌体分型抗血清的制备
12 周龄~16 周龄公鸡颈中部皮下接种1 mL 油乳菌苗（油乳菌苗制苗菌株选用分离自牛的多杀性
巴氏杆菌分离株，制备方法见《中华人民共和国兽药典》“禽多杀性巴氏杆菌病油乳剂灭活疫苗”，3 周
后胸部肌肉内再接种1 mL（在胸骨的两侧各接种0.5 mL）。1 周后采血，分血清，并加0.01% 硫柳汞或
0.06% 石炭酸防腐保存。出现交叉反应的血清应弃去。
16
GB/T 27530—2025
附　录　D
（资料性）
琼脂凝胶免疫扩散试验打孔及结果判定示意图
D.1　琼脂凝胶免疫扩散试验打孔示意图
琼脂凝胶免疫扩散试验使用的琼脂凝胶平板打孔见图D.1。
图D.1　琼脂凝胶免疫扩散试验打孔示意图
D.2　琼脂凝胶免疫扩散试验结果判定示意图
琼脂凝胶免疫扩散试验结果判定示意图见图D.2。
图D.2　琼脂凝胶免疫扩散试验结果示意图
17
GB/T 27530—2025
附　录　E
（资料性）
PCR 阳性对照的制备
E.1　仪器
恒温摇床、制冰机、PCR 仪、核酸电泳仪、凝胶成像仪。
E.2　试剂
5 对引物，浓度均为20 μmol/L，包括多杀性巴氏杆菌属鉴定引物（KMT1T7/KMT1SP6）、A 型多
杀性巴氏杆菌鉴定引物（RGPMA5/RGPMA6）、B 型多杀性巴氏杆菌鉴定引物（CapB⁃F/CapB⁃R）、D
型多杀性巴氏杆菌鉴定引物（CapD⁃F/CapD⁃R）、E 型多杀性巴氏杆菌鉴定引物（CapE⁃F/CapE⁃R）、F
型多杀性巴氏杆菌鉴定引物（CapF⁃F/CapF⁃R），商品化的琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、
pMD⁃19T 质粒、大肠杆菌DH5α 感受态细胞、10 mg/mL 氨苄青霉素和LB 培养基。
E.3　阳性质粒的构建和鉴定
E.3.1　PCR 扩增和产物回收
以提取的多杀性巴氏杆菌DNA 为模板，分别以多杀性巴氏杆菌种属鉴定引物以及各荚膜型的鉴
定引物作为扩增引物，进行PCR 扩增，反应体系：DNA 模板1 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs
（2.5 mmol/L）5 μL，TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，特异性引物R 1 μL，特异性引物F 1 μL，补充蒸
馏水至50 μL。扩增条件为：94 ℃ 3 min 预变性；然后进行35 个循环的扩增（94 ℃变性30 s，54 ℃退火
30 s，72 ℃延伸1 min）；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取5 μL PCR 产物于1% 琼脂糖凝胶中进行
电泳，以确定扩增获得目的基因片段。
E.3.2　质粒构建及鉴定
用商品化胶回收试剂盒分别回收纯化E.3.1 获得的PCR 产物，将纯化DNA 片段分别与pMD⁃
19T 克隆载体连接，转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞，涂布于含100 mg/L 氨苄青霉素的LB 培养基平
板上，37 ℃培养12 h~16 h。挑取单一的白色菌落至含有氨苄青霉素的液体培养基中，于37 ℃、200 r/min
振荡培养至OD600 值（波长600 nm 处的光密度值）1.0~1.2，取菌液2 mL~5 mL，利用质粒提取试剂盒
提取质粒，测序。将序列测定正确的质粒分别命名为pMD⁃19T⁃457、pMD⁃19T⁃564、pMD⁃19T⁃760、
pMD⁃19T⁃657、pMD⁃19T⁃511、pMD⁃19T⁃851，作为多杀性巴氏杆菌属以及5 种多杀性巴氏杆菌荚膜型
PCR 阳性对照。质粒和含有重组子的阳性菌分别保存于-20 ℃和-80 ℃。
18
GB/T 27530—2025
附　录　F
（资料性）
多杀性巴氏杆菌检测引物及扩增序列信息
F.1　检测巴氏杆菌种通用引物扩增序列（457 bp）
ATCCGCTATTTACCCAGTGGGGCGGTGCGAATGAACCGATTGCCGCGAAATTGAGT
TTTATGCCACTTGAAATGGGAAATGGCATTATTTTATGGCTCGTTGTGAGTGGGCTTG
TCGGTAGTCTTTTATTTGGCTTGTGGCAAAGAAAAGCACAGTTTTGTTGGGCGGAGTT
TGGTGTGTTGAGCCAATCTGCTTCCTTGACAACGGCGCAACTGATTGGACGTTATTTA
TTACTCAGCTTATTGTTATTTGCCGGTTTATATTTCCTTGTCAGTCTGATTTATCAAT
ATTTCCATGTTGAGTTACGTTTCTTATGGCCATTATTGAAGCCATTAACGACAGAGCG
GTTTAATTTATTTATCGTGTATTGGTTACCTATTTTGGTCTTTTCTTCGTGTTCCAAC
GGTTTAATCGTGTCAGTCCAAATGAAACAAAAAGTGGCGAGTTCGTTTACAGC
F.2　检测A 型巴氏杆菌引物扩增序列（564 bp）
AATGTTTGCGATAGTCCGTTAGATATTGCAACACAACTGTTACTTTCCAACGTAA
AAAAATTAGTACTTTCTGACTCGGAAAAAAACACGTTAAAAAATAAATGGAAATTGCT
CACTGAGAAGAAATCTGAAAATGCGGAGGTAAGAGCGGTCGCCCTTGTACCAAAAGAT
TTTCCCAAAGATCTGGTTTTAGCGCCTTTACCTGATCATGTTAATGATTTTACATGGT
ACAAAAAGCGAAAGAAAAGACTTGGCATAAAACCTGAACATCAACATGTTGGTCTTTC
TATTATCGTTACAACATTCAATCGACCAGCAATTTTATCGATTACATTAGCCTGTTTA
GTAAACCAAAAAACACATTACCCGTTTGAAGTTATCGTGACAGATGATGGTAGTCAGG
AAGATCTATCACCGATCATTCGCCAATATGAAAATAAATTGGATATTCGCTACGTCAG
ACAAAAAGATAACGGTTTTCAAGCCAGTGCCGCTCGGAATATGGGATTACGCTTAGCA
AAATATGACTTTATTGGCTTACTCGACTGTGATATGGCGCCAAAT
F.3　检测B 型巴氏杆菌引物扩增序列（760 bp）
GCCCGAGAGTTTCAATCCAGTAACTGTTGTGGTAATACATTTTTTCAGAGTTACT
CATTTTGTTATAAGGATACTCTTTGTGTCTTTTTAGATTAATCATTAAGGCGTTACAC
CAATGTAGGTGTTTTGCCAAAAGCTGTTTAATTGACTCAGGAGAGTAAATTTCTGAAG
TATATTTCGCAATTTCCTCATCAAATGTTGAAAAGTCATAAGTATCCTTATGCTCGAT
CAGATGATCGCAAGTGTGTTTATCAAAAATACGATAAGCATTTTGCAGATTAAAGCGT
GTATAACCTACATCTTCCCAACTACTTACATAGGCATCAATATCACCTAGTGGTGCAA
ATTTCTTTTCAAATCTAGGCACAGAATATTCAAAACCCCGTAGCTGGCCACAAATTAA
TAGTGCAATTTTTAATGGTTTTTTCTGCAGTAAAGGTGTTGATGGACGTTGTAAAGAC
TGAATACGTTTTTCTAAAAATTGGTACTCCGTACTACCTAATGTCAGATGGTGTAATG
TTAAGAAGTTTTGGCAAATCTTTCTTTCTTCATCTGAGGACAGCTTTTTACTTTGAGT
TAAAGCTTGTAGAAATGTAATGAAAAAAGCGATATCAATCTGCTTAAGATAATTGCTA
TCTTTAATGAATAACGCAAATAAATAATTAACGATTTCTAGTTTTACCAAAATAAAGT
TCAACTGTGTTTGAGAACACTTTTTTAAAATGAGTAGTATTTCCTCTGGTGGAGCTTG
GATAAATG
19
GB/T 27530—2025
F.4　检测D 型巴氏杆菌引物扩增序列（657 bp）
CATCTACCCACTCAACCATATCAGAAAATAATGAATCTTCACGCATTGTGTTATAA
TACAGTGGTAGAAATAAGTTATTTATCCTATTTTTACCATAGTATTTAATTATTCTAT
GATAAAATTCATCATCCGATGCTTTGGTTGTGCAGTTAAAAAAACCAATTTCATTAAA
TACTTTTCTATAAACGCCTAAAGTTATTAATCCTAATTTGTATTTATTATCATTAACT
TTTATTATATTTTGTGTTTCTAGATTTATTCTAGAATATGCACATCTAACAGCTATAT
TATCTTTATTCGATAATAATGCATTAACACATCTTTCGATTCTTTCATGGTGACATAC
ATCATCGCTATCCTGAAAGAAAATAATATCTCCTTTAGACTTTAAAATTCCTGTATTT
TTCGCAAAGTATGTCCCTAGATTTGAGTTTAATCGGAATGTTTTTACTTTACTTGTAG
AGTTTGCTATTCTGGATGCGATCTGAAATGTTTTATCTGTGCTATAATCATCTACAAC
GATAACTTCTAAGTTATTGTATGTTTGCAATAATAGTGAATTAATTGAGGCTTCAATG
AATTTTTCTGTATTATGAGAAGTCATTATAATACTGACTAGAGGGGGGGCTCCTAGTC
TTTCTTTTGTAA
F.5　检测E 型巴氏杆菌引物扩增序列（511 bp）
TCCGCAGAAAATTATTGACTCTCTAGTATCAGGCGTACCTGTAATTTCTACAAGG
AATACATATTTAGAAGAAAAATTTAAAGACATCATATTATTTATTGATTCCCCAACTC
AACTTCATGAAATTGTAGAAAAATATGAAAATGATCGTTGGGCACATGCTCGCTTAGC
GCACAAAGGATATCGATTTGTAATGAATAATTTTTCCACACATAGTCTCAAAGCTAAC
TTACAAAGAGAAATATGTGGCAAAGCGATCAATTCAGATAATAATCCCTTGATATCGA
TTATTATGGCATCAATGAGAGAATTCTATATAGACAGAATTATTACTAATATTTCTCG
TCAAACATATAAAAATAAAGAGCTTATCATTGTTACTCAGAATTTTTCAGAAATAGGA
TTAAAAAAACTACAAGAAAAATTAGAAAAAATAGATGACTTGGTTAATTTCAAAATC
ATAGTAAATAACTCAGAAGACACTTTAGGAGAAAGACAAAATCAAGCAGCAAGC
F.6　检测F 型巴氏杆菌引物扩增序列（851 bp）
AATCGGAGAACGCAGAAATCAGAAAGGTGGAACTAGTACCCAAAGATTTTCCTAA
AGATCTTGTTCTTGCTCCATTGCCAGATCATGTTAATGATTTTACATGGTACAAAAAT
CGAAAAAAAAGCTTAGGTATAAAGCCTGTAAATAAGAATATCGGTCTTTCTATTATTA
TTCCTACATTTAATCGTAGCCGTATTTTAGATATAACGTTAGCCTGTTTGGTCAATCA
GAAAACAAACTACCCATTTGAAGTCGTTGTTGCAGATGATGGTAGTAAGGAAAACTTA
CTTACCATTGTGCAAAAATACGAACAAAAACTTGACATAAAGTATGTAAGACAAAAAG
ATTATGGATATCAATTGTGTGCAGTCAGAAACTTAGGTTTACGTACAGCAAAGTATGA
TTTTGTCTCGATTCTAGACTGCGATATGGCACCACAACAATTATGGGTTCATTCTTAT
CTTACAGAACTATTAGAAGACAATGATATTGTTTTAATTGGACCTAGAAAATATGTGG
ATACTCATAATATTACCGCAGAACAATTCCTTAACGATCCATATTTAATAGAATCACT
ACCTGAAACCGCTACAAATAACAATCCTTCGATTACATCAAAAGGAAATATATCGTTG
GATTGGAGATTAGAACATTTCAAAAAAACCGATAATCTACGTCTATGTGATTCACCGT
TTCGTTATTTTAGTTGCGGTAATGTTGCATTTTCTAAAGAATGGCTAAATAAAGTAGG
TTGGTTCGATGAAGAATTTAATCATTGGGGGGGCGAAGATGTAGAATTTGGTTACAG
ATTATTTGCCAAAGGCTGTTTTTTCAGAGTAATTGACGGCGGAA
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GB/T 27530—2025
附　录　G
（资料性）
多杀性巴氏杆菌多重PCR 阳性扩增参照图
多杀性巴氏杆菌多重PCR 扩增结果见图G.1。
标引序号说明：
Marker ——DNA 分子质量标准（DL 2 000 Marker）；
A 型——荚膜A 型多杀性巴氏杆菌；
B 型——荚膜B 型多杀性巴氏杆菌；
D 型——荚膜D 型多杀性巴氏杆菌；
E 型——荚膜E 型多杀性巴氏杆菌；
F 型——荚膜F 型多杀性巴氏杆菌。
图G.1　多杀性巴氏杆菌多重PCR 阳性扩增参照图
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GB/T 27530—2025
参考文献
[1]　陆生动物诊断试验和疫苗手册（2022）　世界动物卫生组织
[2]　中华人民共和国兽药典