GB/T 26436-2025 禽白血病诊断技术

中华人民共和国国家标准
ICS 11.220
CCS B 41
GB/T 26436—2025
禽白血病诊断技术
Diagnostic techniques for avian leukosis
2025⁃01⁃24 发布2025⁃08⁃01 实施
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会发 布
代替 GB/T 26436—2010

GB/T 26436—2025
目　　次
前言··························································································································Ⅲ
引言··························································································································Ⅳ
1　范围·······················································································································1
2　规范性引用文件········································································································1
3　术语和定义··············································································································1
4　缩略语····················································································································1
5　实验室生物安全措施··································································································2
6　临床诊断·················································································································2
6.1　流行病学···········································································································2
6.2　临床症状···········································································································2
6.3　病理变化···········································································································3
6.4　鉴别诊断···········································································································3
6.5　临床判定···········································································································3
7　样品采集与处理········································································································4
7.1　样品采集···········································································································4
7.2　样品处理···········································································································4
8　实验室诊断··············································································································4
8.1　病毒分离和鉴定··································································································4
8.2　病毒亚群的鉴定··································································································7
8.3　Real⁃time RT⁃PCR 扩增ALV⁃J···············································································7
8.4　血清学诊断· ·······································································································7
9　综合判定·················································································································8
9.1　疑似·················································································································8
9.2　确诊·················································································································8
附录A（规范性）　病毒分离相关溶液的配制········································································9
A.1　0.01 mol/L PBS（pH 7.4）······················································································9
A.2　50% 甘油⁃PBS 保存液（pH 7.4）··············································································9
A.3　细胞完全营养液和维持液······················································································9
附录B（资料性）　CEF（C/E 品系）的制备··········································································10
附录C（资料性）　抗ALV 单因子鸡血清的制备··································································11
附录D（规范性）　p27 抗原ELISA 检测相关溶液的配制·······················································12
D.1　包被液············································································································12
D.2　洗涤液············································································································12
Ⅰ
GB/T 26436—2025
D.3　样品稀释液······································································································12
D.4　底物溶液·········································································································12
D.5　终止液············································································································12
附录E（资料性）　ALV 亚群鉴定程序···············································································13
E.1　克隆载体和宿主菌·····························································································13
E.2　病毒模板的制备································································································13
E.3　囊膜蛋白 env 基因的扩增·····················································································13
E.4　PCR 产物的克隆· ······························································································14
E.5　质粒DNA 的提取和鉴定· ···················································································15
E.6　克隆序列的测定································································································15
附录F（资料性）　Real⁃time RT⁃PCR 扩增ALV⁃J································································17
F.1　引物和探针序列································································································17
F.2　样品采集和前处理·····························································································17
F.3　核酸抽提·········································································································17
F.4　扩增试剂准备···································································································17
F.5　加样检测·········································································································18
F.6　反应条件设置···································································································18
F.7　荧光素设定······································································································18
F.8　分析条件设定及结果判定····················································································18
附录G（资料性）　ALV⁃J 一步法Real⁃time RT⁃PCR 检测试剂盒的组成及使用···························19
G.1　试剂盒组成······································································································19
G.2　说明···············································································································19
G.3　使用时的注意事项·····························································································19
附录H（资料性）　IFA 法抗体检测用ALV 感染细胞的制备··················································20
参考文献····················································································································21
Ⅱ
GB/T 26436—2025
前 言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规
定起草。
本文件代替GB/T 26436—2010《禽白血病诊断技术》，与GB/T 26436—2010 相比，除结构调整和
编辑性改动外，主要技术变化如下：
——增加了“缩略语”（见第4 章）；
——增加了ALV⁃p27 抗原免疫胶体金试纸卡检测方法（见8.1.4.3）；
——更改了抗体检测结果对确诊的判定标准（见8.4.5，2010 年版的4.3.2.3）。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国农业农村部提出。
本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC 181）归口。
本文件起草单位：山东农业大学、中华人民共和国拱北海关技术中心、华南农业大学、扬州大学、
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、灵羽生工（北京）医药科技有限公司、中国农业大学、普莱柯生物工
程股份有限公司、中国动物疫病预防控制中心。
本文件主要起草人：赵鹏、崔治中、孙淑红、杨素、沙才华、廖明、曹伟胜、秦爱建、钱琨、王一新、
高玉龙、陈西钊、苏敬良、田克恭、吴清民、王传彬。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：
——2010 年首次发布为GB/T 26436—2010；
——本次为第一次修订。
Ⅲ
GB/T 26436—2025
引 言
禽白血病（Avian leukosis，AL）是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）感染引起的禽类多
种肿瘤性疾病的统称，主要引起鸡的恶性肿瘤和亚临床感染，导致鸡只生长迟缓、产蛋下降和免疫抑
制，是一种能够通过种蛋垂直传播的免疫抑制性疾病，我国将其列为三类动物疫病。
ALV 属于反转录病毒科正反录病毒亚科甲型反转录病毒属，根据其gp85 蛋白的特性目前将
ALV 分为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J 和K 共11 个亚群。ALV 分为内源性ALV 和外源性ALV 两大
类。内源性ALV 是指整合进宿主细胞染色体基因组因而能通过染色体垂直传播的ALV，它可能只是
病毒基因组的不完全片段不产生传染性病毒粒子，也可能是病毒全基因组因而能产生传染性病毒粒
子，不过这类病毒通常致病性很低或无致病性，主要是E 亚群ALV。外源性ALV 是与内源性ALV
相对应的，指不通过宿主细胞染色体传递给下一代的ALV，包括A、B、C、D、J 和K 亚群，致病性强的
ALV 均属于外源性病毒。内源性ALV 的干扰是开展实验室检测，特别是进行核酸检测时首要排除
因素。
本病发生没有明显的季节性或地域性，通常因为饲养种源未净化ALV 的鸡苗而发病，以及在育雏
期与感染鸡群混养或者使用存在外源性ALV 污染的生物制品而感染发病。
本文件诊断技术内容包括临床诊断、病原学诊断和血清学诊断方法。本文件的修订参考了世界动
物卫生组织（WOAH）《陆生动物诊断试验和疫苗手册》，并结合了我国相关技术研究新成果。
Ⅳ
GB/T 26436—2025
禽白血病诊断技术
1　范围
本文件描述了禽白血病的临床诊断、样品采集与处理，以及病毒分离和鉴定、病毒亚群的鉴定、
Real⁃time RT⁃PCR、扩增ALV⁃J、血清学诊断等实验室诊断方法。
本文件适用于鸡群中禽白血病的诊断、检测、检疫、监测和流行病学调查。
2　规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用本
文件。
GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088　出入境动物检疫采样
GB/T 18643　鸡马立克氏病诊断技术
GB 19489　实验室生物安全通用要求
NY/T 541　兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
NY/T 1247　禽网状内皮组织增殖症诊断技术
3　术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4　缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AL：禽白血病（Avian leukosis）
ALV：禽白血病病毒（Avian leukosis virus）
CPE：细胞病变效应（Cytopathic effect）
Ct 值：循环阈值（Cycle threshold）
CEF：鸡胚成纤维细胞（Chick embryo fibroblast）
DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethyl pyrocarbonate）
DMEM：杜氏改良Eagle 培养基（Dulbecco’s modification of Eagle’s medium）
dNTP：脱氧核苷三磷酸（Deoxyribonucleoside triphosphate）
EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid）
ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme⁃linked immunosorbent assay）
IFA：间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence assay）
MDV：鸡马立克氏病病毒（Marek’s disease virus）
1
GB/T 26436—2025
PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline）
Real⁃time RT⁃PCR：实时反转录⁃聚合酶链反应（Real⁃time reverse transcription⁃polymerase chain re⁃
action）
REV：禽网状内皮组织增殖症病毒（Reticuloendotheliosis virus）
RNA：核糖核酸（Ribonucleic acid）
RT⁃PCR：反转录⁃聚合酶链式反应（Reverse transcription⁃polymerase chain reaction）
TCID50：半数组织感染剂量（50% tissue culture infective dose）
5　实验室生物安全措施
进行禽白血病实验室诊断时，按照GB 19489 的规定执行。样品采集、保存、运输执行GB/T 18088
和NY/T 541 的要求。本文件中各类试剂配制用水应符合GB/T 6682 的要求。
6　临床诊断
6.1　流行病学
6.1.1　家禽是ALV 的自然宿主，母鸡易感性较高，某些品种的野鸡和鹧鸪也可感染ALV。
6.1.2　性成熟或即将性成熟的鸡群（16 周龄以上鸡群）多发，并呈渐进性。肉鸡最早可在5 周龄引起发
病，平均发病时间为9 周龄，肿瘤致死率通常在20 周龄达最高。蛋鸡通常在20 周龄后发病，性成熟前
后发病相对集中。
6.1.3　通过垂直传播的雏鸡处于免疫低下状态，通过粪便排毒，成为传染源。
6.1.4　感染家禽的外源性ALV 主要包括A、B、J、K 等亚群，肉种鸡和蛋种鸡主要感染J 亚群，黄羽肉
种鸡主要感染J 亚群和K 亚群，某些品种的野鸡中分离到的ALV 毒株属于其他亚群（如F、G、H
亚群）。
6.2　临床症状
6.2.1　鸡感染后通常不表现特异的临诊症状，甚至可能完全没有症状，但可造成鸡群产蛋性能下降、生
长迟缓和免疫抑制等亚临床症状。若表现症状，其典型特征为在性成熟前后发生肿瘤而死亡。
6.2.2　同一亚型的ALV 可以引起不同类型的肿瘤，同一类型的肿瘤也可以由不同亚型的ALV 引发。
由ALV 诱发的常见肿瘤包括淋巴细胞瘤、成红细胞瘤、髓细胞样肿瘤、血管瘤、肾瘤和肾胚细胞瘤、纤
维肉瘤和其他结缔组织瘤、骨硬化病等。
6.2.3　若表现为淋巴细胞瘤，肿瘤主要分布在肝脏、脾脏和法氏囊，质地柔软、有光泽，切面呈淡灰色到
乳白色，瘤体可能呈结节状、粟粒状或弥散性，乃至多种形式组合。
6.2.4　若表现为成红细胞瘤，肿瘤常见于肝脏、脾脏和肾脏，器官肿大，并通常呈樱桃红色到暗褐色，病
死鸡出现全身性贫血及不同程度的出血、水肿或积水，贫血严重时内脏和免疫器官常呈现萎缩。
6.2.5　若表现为髓细胞样肿瘤，髓细胞瘤可发生于肋骨和肋软骨的连接处，胸骨内面以及下颌骨和鼻
腔的软骨上，通常为结节状和弥漫性生长，质地柔软易碎或干酪样。除骨骼肿瘤外，髓细胞的浸润通常
引起肝脏、脾脏和其他器官的肿大。
6.2.6　若表现为血管瘤，肿瘤发生于鸡的皮肤或内脏器官中，表现为充血性的囊性肿块（血疱）或更多
的实体增生性病变。
6.2.7　若表现为肾瘤和肾胚细胞瘤，肿瘤眼观变化不一，从埋在肾实质内的粉灰色小结节，到取代大部
分肾组织的灰黄色分叶状团块均有发生。
2
GB/T 26436—2025
6.2.8　若表现为骨硬化病，病鸡骨骼上通常双侧对称性出现明显的浅黄色病灶，骨膜增厚，病变骨骼呈
海绵状，病变通常环绕骨干并向干骺端发展，使骨骼呈梭形外观。
6.3　病理变化
6.3.1　淋巴细胞性白血病镜下观察，肿瘤由淋巴母细胞的聚集体组成，细胞大小稍有不同，但均处于原
始发育阶段。
6.3.2　成红细胞增多病镜下检查，可见多脏器血窦扩张，其内充满未成熟的成红细胞。
6.3.3　成髓细胞性白血病镜下观察，可见肝脏、脾脏、肾脏等器官血管内外有大量幼稚型髓细胞，分裂
象明显。髓细胞性白血病肿瘤通常由大量均一的、高度分化的髓细胞组成，分裂象明显。
6.3.4　血管瘤镜下可见血管高度扩张、壁薄，呈海绵状特征。
6.3.5　肾瘤和肾胚细胞瘤镜下通常可见上皮和间质成分出现肿瘤样增生，肾小球、肾小囊和肾小管正
常结构畸形。
6.3.6　纤维瘤主要成分为纤维细胞、成纤维细胞和细胞外的胶原纤维；纤维肉瘤的瘤细胞则主要是不
成熟的成纤维细胞。
6.3.7　黏液瘤镜检可见到星芒状的细胞，核分裂象少见，且细胞间有大量淡蓝染的黏液性物质；黏液肉
瘤镜检下与黏液瘤相近，但核分裂象较多见。
6.3.8　组织细胞肉瘤是间叶组织细胞发生的恶性肿瘤，镜检肿瘤细胞具有高度多形性。
6.3.9　骨瘤由均质的嗜酸骨黏蛋白基质组成，其中不规则的间隔含有成骨细胞群。软骨瘤具有典型而
独特的结构，由两个或多个软骨细胞组成的细胞群，分布于均质的软骨黏蛋白基质中，细胞成分从最不
成熟的软骨细胞到完全成熟的软骨细胞等差异较大。
6.3.10　骨硬化病镜下可见嗜碱性成骨细胞的数目增多和体积变大，破骨细胞数目增加但密度减少，哈
氏管的大小和不规则性增加，陷窝的数目和体积增加且位置发生改变。
6.4　鉴别诊断
6.4.1　本病引起的肿瘤病变需要与疱疹病毒感染引起的鸡马立克氏病（MD）以及另一种逆转录病毒感
染引起的禽网状内皮组织增殖症（RE）进行鉴别。
6.4.2　神经型MD 可根据病鸡特征性麻痹症状及外周神经的病理变化确定诊断。内脏型MD 和淋巴
细胞性白血病眼观变化很相似。一般MDV 导致的肿瘤最早可发生于4 周龄；MD 的法氏囊变化通常
是萎缩或弥漫性增厚，而淋巴细胞性白血病常有法氏囊肿瘤。
6.4.3　REV 导致的肿瘤最早可发生于4 周龄，也可诱发16 周龄以上的鸡产生淋巴白血病。REV 可诱
发神经增粗、矮小症和非法氏囊T 细胞淋巴瘤，但一般仅见于实验条件下感染鸡，或注射接种污染疫
苗的鸡。
6.4.4　当发生肿瘤时，应结合实验室病原学检测确定肿瘤与病原的相关性，鸡马立克氏病诊断技术按
照GB/T 18643 执行，禽网状内皮组织增殖症诊断技术按照NY/T 1247 执行。
6.5　临床判定
6.5.1　易感鸡群出现上述典型临床症状和病理变化，可临床判定为疑似AL 病例。
6.5.2　进一步确诊应采集发病期有明显临床症状鸡只的全血、血清及肝、脾等组织脏器和肿瘤组织开
展病原分离鉴定，如有可能应同时采集同一流行病学单元内其他未见明显临床症状易感鸡群的全血、
血清进行实验室诊断。
3
GB/T 26436—2025
7　样品采集与处理
7.1　样品采集
7.1.1　组织样品：无菌采集疑似病鸡的肝脏、脾脏、肾脏等组织，装入样品保存管，加入50% 甘油⁃PBS
保存液，使保存液液面没过样品，加盖封口，冷冻保存。
7.1.2　血液样品：无菌采集发病鸡只EDTA 抗凝血及无抗凝剂添加全血，每只鸡不少于2 mL，密封后
冷藏保存。
7.1.3　咽喉和泄殖腔拭子样品：取咽喉拭子时，将棉拭子深入喉头口及上颚裂来回刮3 次~5 次取咽喉
分泌液；取泄殖腔棉拭子时，将棉拭子深入泄殖腔转3 圈并蘸取少量粪便；将棉拭子头一并放入盛有
1.5 mL PBS 的无菌离心管中（含青霉素100 IU/mL 和链霉素100 μg/mL），加盖封口，冷冻保存。
7.2　样品处理
7.2.1　组织样品：按脏器质量的5 倍~10 倍加入灭菌生理盐水（含青霉素100 IU/mL 和链霉素100 μg/
mL）研磨，直至成匀浆液。将悬液移至离心管中充分摇振后，4 ℃、10 000 r/min 离心5 min，收集上清液
并经0.22 μm 一次性滤器滤过除菌，滤液直接接种细胞培养或-80 ℃保存备用。
7.2.2　EDTA 抗凝血：取EDTA 抗凝血200 μL，用无菌PBS 洗涤2 次~3 次（1 000 r/min，离心5 min）
收获上层血浆层（注意尽可能避免取到红细胞）。经处理的样品当天使用，使用前置于4 ℃保存，剩余
样品置于-80 ℃保存。
7.2.3　无抗凝剂添加全血：按常规方法制备血清。使用前置于4 ℃保存，剩余样品置-20 ℃保存。
7.2.4　咽喉和泄殖腔拭子样品：装有拭子样品的无菌离心管经4 ℃、10 000 r/min 离心5 min，收集上清
液经0.22 μm 一次性滤器滤过除菌备用。接种细胞培养或-80 ℃保存备用。
8　实验室诊断
8.1　病毒分离和鉴定
8.1.1　仪器设备
8.1.1.1　生物安全柜。
8.1.1.2　恒温CO2 细胞培养箱。
8.1.1.3　倒置生物显微镜。
8.1.1.4　台式低温高速离心机。
8.1.1.5　研钵和研杵（或组织匀浆机）。
8.1.1.6　细胞培养瓶或培养皿。
8.1.2　试剂材料
8.1.2.1　0.01 mol/L PBS（pH7.4），按照附录A 中A.1 配制。
8.1.2.2　50% 甘油⁃PBS 保存液，按照A.2 配制。
8.1.2.3　青霉素，浓度为10 000 IU/mL。
8.1.2.4　链霉素，浓度为10 000 μg/mL。
8.1.2.5　细胞完全营养液和维持液，按照A.3 配制。
8.1.2.6　CEF（C/E 品系），制备方法见附录B。
8.1.2.7　抗ALV 单因子鸡血清，制备方法见附录C。
4
GB/T 26436—2025
8.1.2.8　包被液，配制方法按照附录D 中D.1。
8.1.2.9　洗涤液，配制方法按照D.2。
8.1.2.10　样品稀释液，配制方法按照D.3。
8.1.2.11　底物溶液，配制方法按照D.4。
8.1.2.12　终止液，配制方法按照D.5。
8.1.3　病毒的分离培养
8.1.3.1　接种培养：经7.2 样品的采集与处理后无菌滤液或血浆，接种CEF（C/E 品系）或DF1 细胞单
层后，将6 孔细胞培养板放入37 ℃、5% CO2 的细胞培养箱中培养，样品吸附2 h 后弃去所有上清液并
以灭菌的PBS（0.01 mol/L，pH7.4）洗涤细胞，然后每孔更换500 μL 细胞维持液，继续在37 ℃、5%（体
积分数）CO2 的细胞培养箱中培养7 d。
8.1.3.2　细胞传代：将8.1.3.1 培养的细胞传代于加有盖玻片的平皿中，培养7 d。
8.1.4　病毒的鉴定
8.1.4.1　IFA 鉴定
8.1.4.1.1　固定
将盖玻片上的单层细胞，在自然干燥后滴加丙酮⁃乙醇（6∶4）混合液，覆盖单层细胞为宜，室温固定
5 min，待其自然干燥，用于IFA，或置于-20 ℃保存备用。设未感染的空白细胞单层为阴性对照。
8.1.4.1.2　加第一抗体
用0.01 mol/L 灭菌PBS（pH7.4）将单克隆抗体（如抗ALV⁃J 亚群特异性单克隆抗体）或抗ALV
单因子鸡血清稀释至工作浓度，在37 ℃水浴箱作用40 min，然后用无菌PBS 洗涤3 次。
8.1.4.1.3　加FITC 标记第二抗体
按商品说明书用无菌PBS 稀释FITC 标记的山羊抗小鼠IgG 抗体或山羊抗鸡IgG 抗体至工作浓
度（当第一抗体为ALV 特异性单克隆抗体，选用FITC 标记的山羊抗小鼠IgG 抗体作为第二抗体；当
第一抗体为鸡抗ALV 单因子血清，则选用FITC 标记的山羊抗鸡IgG 抗体作为第二抗体），然后添加
至样品孔中。细胞培养板置于37 ℃温箱中作用40 min，然后弃去抗体，用无菌PBS 洗涤3 次。
8.1.4.1.4　加甘油
滴加少量50% 甘油⁃PBS 于载玻片上，将盖玻片上的样品倒扣其上。
8.1.4.1.5　结果观察与判定
在荧光显微镜下观察。阳性对照感染的细胞胞浆内呈现亮绿色荧光，阴性对照无显色，表明实验
成立。被感染的CEF 或DF1 细胞内呈现亮绿色荧光，周围未被感染的细胞不被着色或颜色很淡。在
放大200×~400×时，若观察到CEF 或DF1 细胞内呈现亮绿色荧光，判为ALV 阳性，无亮绿色荧光
者判为阴性。
8.1.4.2　ALV⁃p27 抗原ELISA 检测
8.1.4.2.1　抗原样本制备
将不同样品按照7.2 所述方法处理后接种细胞，培养7 d~14 d 后取上清液直接检测，也可取细胞
培养物冻融后检测。
5
GB/T 26436—2025
8.1.4.2.2　p27 抗原ELISA 检测
使用p27 抗原ELISA 检测商品化试剂盒按说明书进行检测，或按以下程序进行。
a） 用包被液将抗 p27 蛋白抗体（商品化单克隆抗体或免疫实验兔血清）作4 000 倍稀释，每孔
100 μL 加入 96 孔聚苯乙烯板中，4 ℃过夜。取出包被好的聚苯乙烯板，将液体倒弃，每孔加
250 μL 洗涤液漂洗3 次，每次2 min，甩干。
b） 每孔加150 μL 质量浓度为10 mg/L 的明胶封闭液，37 ℃反应60 min。将液体倒弃，每孔加
250 μL 洗涤液漂洗3 次，每次2 min，甩干。
c） 在A1、A2 孔各加100 μL 标准阴性对照（不含有ALV p27 蛋白的SPF 鸡蛋清、空白细胞培
养物等），A3、A4 孔各加100 μL 标准阳性对照（含有ALV p27 蛋白的SPF 鸡蛋清、ALV 细
胞培养物等）。
d） 将待检样品以样品稀释液作100 倍稀释，加入其他各孔，每孔100 μL，37 ℃反应60 min。将
液体倒弃，每孔加250 μL 洗涤液漂洗3 次，每次2 min，甩干。
e） 每孔加 100 μL 工作浓度的辣根过氧化物酶标记的抗p27 蛋白抗体，37 ℃反应60 min。将液
体倒弃，每孔加250 μL 洗涤液漂洗3 次，每次2 min，甩干。
f） 每孔加 100 μL 新配制的底物溶液，室温避光反应 10 min。
g） 每孔加 100 μL 终止液。
h） 置酶联检测仪于波长450 nm 测定各孔光密度值（OD 值）。
8.1.4.2.3　结果判定
读取OD 值，计算S/P 值，按式（1）计算：
S/P=（OD450⁃S—OD450⁃NC）/（OD450⁃PC—OD450⁃NC）
式中：
S/P ——样品数值；
OD450⁃S ——待检样品在波长450 nm 处的OD 值；
OD450⁃PC ——阳性对照样品在波长450 nm 处的平均 OD 值；
OD450⁃NC ——阴性对照样品在波长450 nm 处的平均 OD 值。
当OD450⁃NC<0.15 且OD450⁃PC-OD450⁃NC>0.3 时，试验结果有效，否则，应重新进行试验。
在试验成立的前提下，待检样品S/P 值>0.2，判为p27 抗原阳性；待检样品S/P 值≤0.2，判为
p27 抗原阴性。DF l 或CEF（C/E 品系）细胞上清液检测出ALV⁃p27 抗原时，判为外源性ALV 阳性，
否则判为阴性。普通CEF 细胞上清液检测出ALV⁃p27 抗原时，无法区分是否有外源性ALV 或内源
性ALV，需转接DFl 细胞后判定。
8.1.4.3　ALV⁃p27 抗原免疫胶体金试纸卡检测
8.1.4.3.1　抗原样本制备
将不同样品按照7.2 所述方法处理后接种细胞，培养7 d~14 d 后取上清液直接检测，也可取细胞
培养物冻融后检测。
8.1.4.3.2　p27 抗原免疫胶体金试纸卡检测
可用商品试剂盒检测，按厂家的说明书操作。从2 ℃~8 ℃冰箱中取出带包装的试纸卡，在室温
（20 ℃~25 ℃）放置约30 min。打开试纸卡的密封包装袋，检查试纸卡是否正常。如试纸卡已变形、变
6
GB/T 26436—2025
色或受潮则不能使用。将试纸卡平放于操作台面，加样孔朝上，向加样孔中加入待检样品，室温静置
5 min，观察结果。
8.1.4.3.3　结果判定
如果对照线（C 线）和检测线（T 线）均显色，则为阳性；对照线显色而检测线不显色，则为阴性。如
果对照线不显色，则检测无效，需换用另一根试纸卡重新检测。阳性对照和阴性对照符合上述判定标
准时，表明实验成立。当样本在DFl 细胞或CEF（C/E 品系）培养后上清液检测出ALV⁃p27 抗原时，
判为外源性ALV 阳性，否则判为阴性。
8.2　病毒亚群的鉴定
8.2.1　按照8.1.4.1 方法，利用J 亚群ALV 特异性单克隆抗体进行IFA 检测，可鉴定J 亚群ALV，但
不能鉴别其他ALV 亚群（如A 亚群、B 亚群、C 亚群、D 亚群、K 亚群）。
8.2.2　对分离得到的病毒用RT⁃PCR（针对上清液中的游离病毒RNA）或PCR（针对细胞中的前病毒
cDNA）扩增和克隆囊膜蛋白env 基因，测序后与基因序列数据库（GenBank）中已知ALV 的A 亚群、B
亚群、C 亚群、D 亚群、E 亚群、J 亚群和K 亚群的env 基因序列做同源性比较，即可根据同源性对病毒
进行分群。ALV 亚群鉴定程序见附录E。
8.3　Real⁃time RT⁃PCR 扩增ALV⁃J
受不同鸡群中复杂的内源性ALV 核酸干扰，该方法在进行确诊时存在假阳性风险，仅适用于鸡群
的快速检疫或ALV⁃J 感染的初步筛查。血浆、组织样品或泄殖腔拭子样品可直接用于检测，见附录
F。J 亚群禽白血病病毒一步法Realtime RT⁃PCR 检测试剂盒的组成及使用见附录G。
8.4　血清学诊断
8.4.1　仪器设备
8.4.1.1　酶标仪。
8.4.1.2　恒温培养箱。
8.4.1.3　洗板机。
8.4.1.4　微量可调移液器（2.5 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL 等不同规格）。
8.4.1.5　ELISA 反应板和枪头。
8.4.2　试剂材料
8.4.2.1　禽白血病J 亚型抗体ELISA 检测试剂盒。
8.4.2.2　禽白血病AB 亚型抗体ELISA 检测试剂盒。
8.4.3　ELISA 检测
选用商品化的禽白血病AB 抗体ELISA 检测试剂盒及J 亚群抗体ELISA 检测试剂盒，按说明书
操作和判定。J 亚群抗体ELISA 检测试剂盒可检测出J 亚群ALV 感染产生的抗体或J 亚群同源
gp85 蛋白诱导产生的抗体，AB 抗体ELISA 检测试剂盒可检出A 亚群、B 亚群及K 亚群ALV 感染产
生的抗体或相应亚群gp85 蛋白诱导产生的抗体。
8.4.4　IFA 检测
8.4.4.1　抗原制备
抗原制备方法见附录H。
7
GB/T 26436—2025
8.4.4.2　操作步骤
在相应的盖玻片上或抗原孔中加入用PBS 稀释的待检鸡血清，在37 ℃下作用40 min，用无菌
PBS 洗涤3 次。再加入工作浓度的FITC 标记的山羊抗鸡IgG 抗体，在37 ℃ 作用40 min，用无菌
PBS 洗涤3 次，加少量50% 甘油⁃PBS 后在荧光显微镜下观察。 结果的判定方法同8.1.4.1.5。
8.4.5　血清学结果的判定
当待检鸡群检出A 亚群、B 亚群、K 亚群及J 亚群抗体阳性时，表明该群鸡可能曾经有过外源性
ALV 感染，确诊需按照8.1 进行病毒分离鉴定。
9　综合判定
9.1　疑似
通过临床诊断判为可疑或疑似病例。符合8.4.5 中的阳性情况，初步判定为外源性ALV 感染可
疑病例。
9.2　确诊
经临床诊断判为可疑或疑似病例的鸡只，符合8.1 经DF1 细胞或CEF（C/E 品系）细胞病毒分离
为阳性结果时，判定被检样品为外源性ALV 感染引起的病例。经8.2 确定亚群的，可判定被感染鸡中
外源性ALV 的亚群。
8
GB/T 26436—2025
附　录　A
（规范性）
病毒分离相关溶液的配制
A.1　0.01 mol/L PBS（pH 7.4）
称取 8.00 g 氯化钠（NaCl）、0.20 g 氯化钾（KCl）、1.42 g 磷酸氢二钠（Na2HPO）、0.27 g 磷酸二氢钾
（KH2PO4）加去离子水溶解至1 000 mL，调节pH 至 7.4，103 kPa 高压蒸汽灭菌 30 min，室温保存。
A.2　50% 甘油⁃PBS 保存液（pH 7.4）
将 0.01 mol/L PBS 与纯甘油（分析纯）等量混合，调节pH 至7.4，分装为小瓶，103 kPa 高压蒸汽
灭菌30 min。室温或4 ℃保存。
A.3　细胞完全营养液和维持液
A.3.1　DMEM 基础营养液（pH 7.2）
可购买商品化液体DMEM 基础培养基，也可购买粉状DMEM 基础培养基自行配置，根据商品说
明书将DMEM 粉加入相应体积蒸馏水中过滤除菌，4 ℃保存备用。
A.3.2　细胞完全营养液（pH 7.2）
取 900 mL 的DMEM 基础营养液加100 mL 的灭活胎牛血清混合，配制成1 000 mL 溶液，加入青
霉素至终浓度100 IU/mL，链霉素至终浓度 100 μg/mL，4 ℃保存备用。
A.3.3　细胞维持液（pH 7.2）
取 990 mL 的DMEM 基础营养液加10 mL 的灭活胎牛血清混合，配制成1 000 mL 溶液，加入青
霉素至终浓度100 IU/mL，链霉素至终浓度 100 μg/mL，4 ℃保存备用。
9
GB/T 26436—2025
附　录　B
（资料性）
CEF（C/E 品系）的制备
选择9 日~10 日龄发育良好的SPF 鸡胚。先用碘酒棉再用酒精棉消毒蛋壳气室部位，无菌取出
鸡胚放入灭菌的玻璃器皿内，去除头、四肢和内脏，用无血清的DMEM 培养基液洗涤胚体。用灭菌的
剪刀剪成米粒大的小组织块，再用无血清的DMEM 培养基液洗2 次~3 次，然后加0.25% 胰酶溶液
（每个鸡胚约加1 mL），在37.5 ℃~38.5 ℃水浴中消化10 min ~15 min。吸出胰酶溶液消化产生的悬
液，再加入适量的营养液（用无血清的DMEM 培养基液，加青霉素100 IU/mL、链霉素100 μg/mL）吹
打，用4 层纱布或一次性铜网滤过。取少量过滤后的细胞悬液做细胞计数，其余在1 000 r/min 下离心
5 min。将细胞沉淀再混悬于细胞培养液中，制成每毫升含活细胞数约100 万~150 万的细胞悬液，分
装于T25 培养瓶（皿）中，进行培养。形成单层后备用（一般在24 h 内应用）。
10
GB/T 26436—2025
附　录　C
（资料性）
抗ALV 单因子鸡血清的制备
选择经鉴定无任何其他潜在病毒污染的ALV 参考株作为种毒（如经ALV⁃J 全基因组cDNA 克
隆质粒DNA 转染SPF 鸡的CEF 所产生的分子克隆化ALV），接种DF1 或CEF（C/E 系）后复制和
扩增病毒。病毒接种细胞继续培养5 d 后，再传代一次。将传代长成单层的细胞培养液换成含1% 胎
牛血清的DMEM 维持液，继续培养72 h~96 h 后收取上清液（通常可达到最高病毒效价），分装在小试
管中，每支1 mL，于-80 ℃冰箱保存。2 d~3 d 后，取出一支，用细胞培养液作10 倍系列稀释后，分别
接种于含有新鲜配制的细胞单层（细胞覆盖面70%）96 孔培养板上，每个稀释度8 孔。在37 ℃下培养
6 d 后，弃上清液，用PBS 洗一次后，加入预冷的丙酮⁃乙醇（6∶4）固定。待自然干燥后，用抗ALV⁃J 的
单克隆抗体进行IFA（见8.1.4.1），以IFA 的结果来判定病毒感染的终点，测定其中ALV 的TCID50
量。选用6 周龄以上SPF 鸡，隔离器饲养。每只鸡皮下接种104 TCID50 的ALV 悬液。4 周~6 周后
采集血清。IFA 抗体滴度≥1∶100。
11
GB/T 26436—2025
附　录　D
（规范性）
p27 抗原ELISA 检测相关溶液的配制
D.1　包被液
分别称取碳酸钠1.59 g、碳酸氢钠2.93 g，加蒸馏水至1 000 mL，充分溶解备用。
D.2　洗涤液
在1 000 mL 的无菌PBS 中加入0.5 mL 吐温⁃20，充分溶解备用。
D.3　样品稀释液
含10%（体积分数）新生牛血清的洗涤液。
D.4　底物溶液
分别称取柠檬酸3.26 g、十二水磷酸氢二钠12.9 g，加蒸馏水至700 mL，配制成（pH5.0）磷酸盐⁃柠
檬酸缓冲液，充分溶解备用。
用二甲基亚砜配制质量浓度为10 mg/L 的3′3′5′5′⁃四甲基联苯胺溶液（TMB），4 ℃保存。使用时
分别量取磷酸盐⁃柠檬酸缓冲液9.9 mL、1% TMB 0.1 mL、30% 过氧化氢1 μL 充分混匀后备用。
D.5　终止液
量取硫酸58 mL，加入蒸馏水442 mL，充分混匀后备用。
12
GB/T 26436—2025
附　录　E
（资料性）
ALV 亚群鉴定程序
E.1　克隆载体和宿主菌
商品化的PCR 产物克隆载体质粒，或其他类似载体质粒。可用多种大肠杆菌作为宿主菌，如TGl 等。
E.2　病毒模板的制备
使用商品化细胞DNA 提取试剂盒按说明书提取模板DNA，或按以下程序提取模板DNA。
a） 接种病毒的细胞经磷酸盐缓冲液洗涤3 次，加入适量0.25% 胰酶，37 ℃温箱中放置5 min~
10 min，将细胞消化吹打后收集于1.5 mL 离心管中。
b） 2 000 r/min 离心收获细胞，然后加入500 μL 抽提缓冲液（100 mmol/L 氯化钠，10 mmol/L
Tris⁃HCl pH8.0，25 mmol/L EDTA pH8.0，0.5%SDS）悬浮后，加入5 μL 蛋白酶K（ 100 μg/mL），
56 ℃水浴中消化5 h。
c） 加入等体积的苯酚⁃三氯甲烷溶液（苯酚∶三氯甲烷∶异戊醇=25∶24∶1）约500 μL 抽提一次，
将上层液体转移至另一1.5 mL 离心管中，加入1/10 体积3 mol/L 乙酸钠和2 倍体积无水乙
醇后，置于-20 ℃冷却2 h 或者更长时间。
d） 取出后12 000 r/min 离心10 min 沉淀DNA，弃去上清液。再小心加入70%（体积分数）冷乙
醇轻洗DNA 沉淀，弃去上清液。
e） 经乙醇沉淀后的DNA，空气中室温自然干燥后，溶解于50 μL 双蒸水中，即为模板DNA。
E.3　囊膜蛋白 env 基因的扩增
E.3.1　引物
可根据已发表资料合成扩增ALV⁃J 的前病毒DNA 特异性PCR 引物，本例示范引物为：
——正向引物：5′⁃CTTGCTGCCATCGAGAGGTTACT⁃3′，相当于ALV⁃J 原型毒株HPRS⁃103
前病毒基因组DNA 序列的第5394 对~第5416 对碱基；
——反向引物：5′⁃AGTTGTCAGGGAATCGAC⁃3′，相当于ALV⁃J 原型毒株HPRS⁃103 前病毒
基因组DNA 序列的第7811 对~第7794 对碱基。
引物用双蒸水稀释为25 pmol/μL，-20 ℃保存备用。
E.3.2　PCR
以E.2 中提取的细胞DNA 为模板，扩增ALV⁃J 的囊膜蛋白基因（env）特异性2.2 kb 条带，其
PCR 反应体系（50 μL）见表E.1。可采用同等扩增效率的商品化PCR 试剂盒。
表E.1　ALV⁃J env 基因PCR 反应体系
组　分
双蒸水
10×缓冲液（无Mg2+）（成分：100 mmol/L Tris⁃HCl pH8.0，500 mmol/L 氯化钾，1% 明胶）
氯化镁（15 mmol/L）
体积/μL
30.5
5.0
4.0
13
GB/T 26436—2025
表E.1　ALV⁃J env 基因PCR 反应体系（ 续）
组　分
dNTPs（2.5 mmol/L）
正向引物（25 pmol/μL)
反向引物（25 pmol/μL)
DNA 聚合酶（5 U/μL）
模板DNA（约100 ng/μL)
总体积
体积/μL
4.0
2.0
2.0
0.5
2.0
50.0
将上述成分分别加入灭菌的PCR 管中，轻轻混合均匀，离心后置于PCR 扩增仪。扩增程序为：
95 ℃ 预变性5 min；95 ℃ 变性1 min，50 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸150 s，进行30 个循环；72 ℃ 延伸
10 min。扩增产物4 ℃保存。
E.3.3　PCR 产物DNA 电泳
用微量移液器取4.5 μL PCR 产物加入0.5 μL 的10×进样缓冲液（0.25% 溴酚蓝，0.25% 甲苯苯
胺，15% 聚蔗糖400），在0.8% 琼脂糖凝胶上进行电泳，同时在另一加样孔加入5 μL DL2000 DNA
Marker。在TAE 电泳缓冲液［由三羟甲基氨基甲烷（Tris base）、乙醇（acetic acid）和EDTA 组成］中，
90 V 电压，电泳50 min 后，于紫外光凝胶成像分析系统中观察并记录结果。
E.3.4　PCR 产物的回收与定量
可采用商品化PCR 产物回收试剂盒进行回收。
E.4　PCR 产物的克隆
E.4.1　连接反应
将载体与纯化回收PCR 产物于16 ℃下连接6 h~8 h。连接体系为：
——25 ng 载体；
——100 ng 纯化env 基因PCR 产物；
——5 μL 溶液I。
加双蒸水至10 μL。
E.4.2　质粒转化用感受态大肠杆菌的制备
用氯化钙法制备大肠杆菌TGl 菌株的感受态细胞，步骤简述如下。
a） 一个盛约50 mL LB 液体培养基的锥形瓶，接种大肠杆菌TGl 菌株，在37 ℃恒温振荡器中振
荡培养至半浑浊半透明状态。
b） 在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的-20 ℃保存的50 mL 离心管中，冰浴放置10 min，使
培养物冷却至0 ℃。
c） 4 ℃以4 000 r/min 离心10 min，回收细菌细胞。
d） 倒出上清液，将管倒置1 min，以使残余的培养液流尽。
e） 用10 mL 用冰预冷的0.1 mol/L 氯化钙重悬每份沉淀，冰浴放置30 min。
f） 4 ℃以4 000 r/min 离心10 min，回收细菌细胞。
14
GB/T 26436—2025
g） 倒出上清液，将管倒置1 min，以使残余的培养液流尽。
h） 每50 mL 初始培养物用l mL 用冰预冷的0.1 mol/L 氯化钙重悬每份沉淀，4 ℃保存备用。
E.4.3　质粒的转化
将E.4.1 中得到的连接产物转化大肠杆菌，步骤简述如下。
a） 10 μL 连接产物加入200 μL 新鲜制备的TGl 感受态细胞中，混匀内容物，冰浴上放置30 min。
b） 放入42 ℃循环水浴中，准确热激90 s。
c） 快速转移至冰浴中，使之冷却2 min~3 min。
d） 每管加LB 培养基800 μL，在37 ℃摇床上（转速不超过220 r/min），温育45 min，使细菌复苏。
e） 取200 μL 菌液均匀涂布到含有100 μg/μL 氨苄青霉素的LB 琼脂平板上。
f） 将平板置于37 ℃温箱中培养12 h，挑取单个菌落培养后，进行质粒DNA 的制备与鉴定。
E.5　质粒DNA 的提取和鉴定
E.5.1　质粒DNA 的提取
挑选平板上的白色菌落，接种至氨苄青霉素浓度为50 μg/mL 的5 mL LB 液体培养基中，于37 ℃
摇床上振荡培养6 h，提取质粒，可选用商品化质粒提取试剂盒按照说明书提取，也可参照如下步骤。
a） 将培养液倒入1.5 mL 离心管中，12 000 r/min，离心1 min，倒掉上清液。用1 mL TE Tris⁃
EDTA 缓冲液悬浮菌体沉淀，再离心回收菌体。
b） 将沉淀悬浮于100 μL 用冰预冷的溶液Ⅰ，在振荡器上强烈振荡混匀。
c） 加200 μL 溶液Ⅱ（不超过5 min，溶液Ⅱ需现配），颠倒5 次（不要强烈振荡），冰浴中放置3 min。
d） 加150 μL 溶液Ⅲ，温和振荡10 s，冰浴中放置3 min~5 min。
e） 12 000 r/min 离心5 min，将上清液转移至另一离心管中，加入等体积的苯酚⁃三氯甲烷，在振
荡器上振荡混匀。
f） 12 000 r/min 离心5 min，将上清液转移至另一离心管中，加入2 倍体积的无水乙醇。
g） 12 000 r/min 离心10 min~15 min，用1 mL70%（体积分数）乙醇漂洗沉淀，干燥DNA 沉淀。
h） 用50 μL 双蒸水或TE 缓冲液溶解沉淀，同时加入0.5 μL~1 μL RNase。-20 ℃保存备用。
E.5.2　重组质粒DNA 的酶切鉴定
以质粒上带有的酶切位点使用相关内切酶进行双酶切鉴定。酶切体系如下：
——10 μL 质粒DNA；
——7 μL 双蒸水；
——2 μL 10×缓冲液K；
——0.5 μL EcoR Ⅰ；
——0.5 μL Hind Ⅲ。
使总体积为20 μL，以上组分混匀后，轻微离心，37 ℃酶切2 h。于0.8% 琼脂糖凝胶中90 V 电泳
45 min，在凝胶成像系统下观察并记录结果。
E.6　克隆序列的测定
将上一步经EcoR Ⅰ 和Hind Ⅲ 双酶切鉴定的阳性克隆测序。所得序列与GenBank 中发布的
ALV 的A 亚群、B 亚群、C 亚群、D 亚群、E 亚群、J 亚群和K 亚群的囊膜蛋白env 基因做同源性比较
分析，并确定属于哪个亚型。可参考的GeneBank 中序列编号分别为：M37980 和DQ365814（A 亚型）；
AF052428（B 亚型）；J02342（C 亚型）；D10652（D 亚型）；M12172、EF467236 和AY013303（E 亚型）；
15
GB/T 26436—2025
Z46390、AF247391、DQll6805、AY897219 和EU264064（J 亚型）；KY773911 和MG770235（K 亚型）。
对于A 亚群、B 亚群、C 亚群、D 亚群、K 亚群和E 亚群，核苷酸或氨基酸的同源性应分别大于90%，与
哪个参考亚型的同源性最高，即确定是这个亚型。对于J 亚群，应与大多数已知J 亚群序列的同源性
大于80%。
16
GB/T 26436—2025
附　录　F
（资料性）
Real⁃time RT⁃PCR 扩增ALV⁃J
F.1　引物和探针序列
选择ALV⁃J 特异性env 基因序列作为ALV⁃J 检测的靶序列，产物长度为138 bp。
上游引物：5′⁃AGAAAGACCCGGAGAAGAC⁃3′；
下游引物：5′⁃ACACGTTTCCTGGTTGTT⁃3′；
TaqMan 探针：5′⁃ATTTCCGTTGTCCCAGGGGTGG⁃3′，其5′端和3′端分别标记FAM 和BHQ。
F.2　样品采集和前处理
样品采集和前处理按照第7 章。
F.3　核酸抽提
使用商品化细胞DNA 提取试剂盒按说明书提取模板DNA 或按以下程序提取模板DNA。
a） 取n 个灭菌的1.5 mL 离心管编号（n 为被检样品与阴性对照、阳性对照之和）。
b） 每管加入600 μL 裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200 μL，再加入200 μL
三氯甲烷，混匀器上振荡混匀5 s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀）。于
4 ℃、12 000 r/min 离心15 min。
c） 取与步骤a）相同数量灭菌的1.5 mL 离心管，加入400 μL 异丙醇（-20 ℃ 预冷），做标记。吸
取步骤b）各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500 μL，尽量避免吸出中间
层，颠倒混匀。
d） 于4 ℃、12 000 r/min 离心15 min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清
液，倒置于吸水纸上，蘸干液体（不同样品需在吸水纸不同地方蘸干）；加入600 μL 75%（体积
分数）乙醇，颠倒洗涤。
e） 于4 ℃、12 000 r/min 离心10 min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清
液，倒置于吸水纸上，尽量蘸干液体（不同样品需在吸水纸不同地方蘸干）。
f） 4 000 r/min 离心10 s（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管
底部，小心倒去上清液，用微量加样器将其吸干，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥5 min~
10 min。
g） 加入15 μL DEPC 水，溶解管壁上的RNA，5 000 r/min 离心5 s，冰浴保存备用。若需长期保
存需放置-70 ℃ 冰箱。
F.4　扩增试剂准备
在反应混合物配制区进行。取出ALV⁃J 一步法Real⁃time RT⁃PCR 检测试剂盒（见附录G），在室
温下融化后，6 000 r/min 离心5 s，每个PCR 反应体系按表F.1 所示用量配制PCR 反应混合液（需配
制反应液数量为样本个数、阴性对照、阳性对照的和再加1）。
17
GB/T 26436—2025
表F.1　PCR 反应体系
试　 剂
RT⁃PCR 反应液
Taq 酶（5 U/μL）
逆转录酶
用量/μL
14.5
0.25
0.25
将以上PCR 反应试剂按使用量吸取至一个离心管中，充分混匀，然后在每个PCR 管中分装15 μL，
转移至样本处理区。
F.5　加样检测
在已分装有PCR 反应混合液的PCR 管中分别加入已提取好的核酸10 μL，盖上管盖，将PCR 管
放入荧光PCR 检测仪内，记录样本放置顺序。在扩增检测区进行。
F.6　反应条件设置
第一步：42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min。
第二步：95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，5 个循环。
第三步：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。
60 ℃时设置采集荧光。
F.7　荧光素设定
报告基团（report dye）设定为FAM，淬灭基团（quench dye）设定为BHQ（或Tamra 或Eclipse），
Reference dye 设定为None。
F.8　分析条件设定及结果判定
F.8.1　质控标准
F.8.1.1　综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值设定原则以阈值线
刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪声情况进行调整，选择FAM 通道
进行分析。
F.8.1.2　ALV⁃J 阳性对照和阴性对照质控标准：阳性对照呈现典型S 型扩增曲线，且Ct 值≤30；阴性
对照无S 型扩增曲线，且无Ct 值。否则此次实验结果无效，应重新进行实验。
F.8.2　结果判定及描述
F.8.2.1　样本Ct 值≤30 且呈S 型扩增曲线，表明ALV⁃J 核酸阳性。样本无Ct 值且无S 型扩增曲线，
表明ALV⁃J 核酸阴性。
F.8.2.2　对于30 性，否则判为阴性。样品中ALV⁃J 核酸阳性，表明相应样品中检出该病毒，相应鸡有ALV⁃J 感染。
18
GB/T 26436—2025
附　录　G
（资料性）
ALV⁃J 一步法Real⁃time RT⁃PCR 检测试剂盒的组成及使用
G.1　试剂盒组成
每个试剂盒可做48 个检测，包括以下成分：
——1 管750 μL RT⁃PCR 反应液；
——1 管12.5 μL Taq 酶；
——1 管12.5 μL 逆转录酶；
——1 管1.0 mL 阴性对照；
——1 管1.0 mL 阳性对照；
——1 管1.0 mL DEPC 水；
——1 管30 mL 裂解液。
G.2　说明
G.2.1　RT⁃PCR 反应液（1×）：含50 mmol/L KCl ，10 mmol/L Tris⁃HCl（ pH8.3），2.5 mmol/L MgCl2，
0.2 mmol/L dNTP 混合物，上、下游引物各20 nmol/mL，探针10 nmol/mL，1U Taq 酶，100 U 逆转录
酶，2 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT），5% 甘油。
G.2.2　阳性对照：ALV⁃J 靶基因RNA 经稀释保存于75%（体积分数）乙醇中。
G.2.3　裂解液为Trizol，于4 ℃保存，也可采用功能等效的提取试剂。
G.3　使用时的注意事项
G.3.1　在检测过程中，需严防不同样品间的交叉污染。
G.3.2　反应液分装时避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。
19
GB/T 26436—2025
附　录　H
（资料性）
IFA 法抗体检测用ALV 感染细胞的制备
在已铺满DF1 或CEF（C/E 系）单层细胞的细胞瓶或培养皿中接种0.5 mL 含103 TCID50 的ALV
（如ALV⁃J）悬液，37 ℃、5%（体积分数）CO2 恒温培养箱中培养，24 h 后换1% 胎牛血清的DMEM 培
养基继续培养。继续培养5 d 后将细胞单层用0.25% 胰酶溶液消化分散成悬液，经离心后，重新悬浮
于5% 胎牛血清的DMEM 培养基中。将细胞浓度调至每毫升5×105 个细胞。在加入盖玻片的培养
皿中加入5 mL 细胞悬液，或在96 孔细胞培养板上每孔加入100 μL 细胞悬液。在37 ℃继续培养4 d。
将盖玻片从培养皿中取出或96 孔细胞培养板弃去培养基，经无菌PBS 漂洗一次后，滴加预冷的丙酮⁃
乙醇（6∶4）固定液室温固定5 min。自然干燥后，用塑料薄膜包裹后置于-20 ℃保存。
20
GB/T 26436—2025
参考文献
[1]　Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (WOAH)