T/CVMA 219-2025 犬细小病毒时间分辨荧光免疫层析检测方法

　　ICS 11.220

CCS B 41

团体标准

T/CVMA 219—2025

犬细小病毒时间分辨荧光免疫层析　检测方法

TRFIA for detection of canine parvovirus

2025 - 2 - 14 发布2025 - 2 - 14 实施

中国兽医协会发 布

 

前言

本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中国农业科学院特产研究所提出。

本文件由中国兽医协会归口。

本文件起草单位：中国农业科学院特产研究所、中国农业科学院兰州兽医研究所。

本文件主要起草人：白雪、刘佳佳、郑海学、田宏、罗俊聪、张成琪、孙亚杰、胡博、刘志杰、许

丽文、李双双、赵冠宇。

 

1 范围

本文件规定了犬细小病毒时间分辨荧光免疫层析检测方法的试剂与耗材、技术原理、操作步骤、

结果计算、试验成立条件及结果判定等内容。

本文件适用于检测犬粪便中的CPV抗原，可用于CPV的免疫筛查、辅助诊断等。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本

文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

GB 19489 实验室生物安全通用要求

NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

时间分辨荧光免疫层析技术 Time resolved fluorescence immunochromatographic assay;TRFIA

是利用时间分辨荧光微球作为示踪物，将其标记到抗体(或抗原)上，在固相层析材料构建的体

系中发生特异性免疫反应后形成复合物，通过测定荧光信号强度从而实现待测物快速定量的分析技

术。

3.2

犬细小病毒 Canine parvovirus;CPV

是细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒亚科(Parvovirinae)、原型细小病毒属(Protoparvovirus)、

食肉动物细小病毒1(Carnivore Protoparvovirus 1)的成员，是一种单链脱氧核苷酸病毒，临床上可引

起出血性肠炎和急性心肌炎等。

4 技术原理

采用双抗体夹心法的原理，检测犬粪便样本中的CPV抗原。当粪便样本中CPV抗原与荧光纳米微球

标记的CPV抗体反应后形成免疫复合物，继续与硝酸纤维素膜上检测线包被的CPV抗体形成双抗体夹心

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免疫结合物，其余物质继续向前层析，荧光微球标记物与质控线上的抗体结合形成免疫复合物，最后用

荧光分析仪读取检测卡上的荧光信号。

5 仪器、材料与试剂

5.1 仪器

5.1.1 便携式荧光分析仪：适用于检测波长为365 nm/610 nm 的荧光信号强度。

5.1.2 单道微量移液器(0.5 μL ~ 10 μL;10 μL ~ 100 μL;20 μL ~ 200 μL)。

5.1.3 2 ℃ ~ 8 ℃冰箱、﹣20 ℃冰箱。

5.2 材料

5.2.1 CPV 阳性粪便、CPV 阴性粪便、采样用拭子。

5.2.2 CPV 时间分辨荧光免疫层析检测卡，其制备见附录A。

5.3 试剂

5.3.1 水按照GB/T 6682 中的要求，二级。

5.3.2 样品稀释液、封闭液、样品垫处理液及相关试剂，按照附录B 的要求配制。

6 实验前准备

6.1 样品的采集

按照NY/T 541中的规定进行样品的采集与处理，并做好个人防护。握住肛拭子手柄端，将肛拭子

插入犬肛门的1 ~ 2 cm处擦拭或在肛门内轻轻旋转3 ~ 5圈后取出。

6.2 样品的贮存

样品在2℃ ~ 8℃冷藏，可保存24 h。若需长时间保存，应将样品置-20 ℃以下保存。按照GB 19489

的规定做好生物安全工作。

7 操作步骤

7.1 样品处理

将采集样本的肛拭子放入含有至少500 μL样本稀释液的管中，充分搅拌混匀后静置1 min，上

清液即为检测液。

7.2 加样及孵育

从原包装铝箔袋中取出CPV时间分辨荧光免疫层析检测卡，置于平坦干净的台面上，用移液器吸取

样本稀释液管中的检测样本，垂直缓慢滴加100 μL于加样孔内，避光常温放置15 min。

7.3 仪器检测

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将孵育后的检测卡放入便携式荧光分析仪进行检测，5 min内完成读值。

7.4 结果计算

便携式荧光免疫分析仪通过365/610 nm 光波激发和收集检测线(T 线)和质控线(C 线)上的荧

光信号，仪器将检测线(T 线)和质控线(C 线)上的荧光信号值转换成数值(T 值和C 值)，T/C 值

即为样本中CPV 抗原的检测值(软件自带计算功能，能准确计算出T/C 值)。

8 试验成立条件

当仪器完成读值后，检测值显示“无效”，说明仪器未检测到荧光信号，则实验不成立，需重新检

测。

如果检测值显示数值，说明质控线和检测线荧光信号值正常，则实验成立。

9 结果判定

当检测值<0.1 时，判为CPV 抗原阴性。

当检测值≥0.1 时，判为CPV 抗原阳性。

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附 录 A

(规范性)

犬细小病毒时间分辨荧光免疫层析检测卡的制备

A.1 质控血清的制备

A.1.1 犬细小病毒阳性血清的制备

犬细小病毒阳性血清，将犬细小病毒(TCID50=106.67/mL)56 ℃灭活72 h，离心取上清液，用抗原

检测为阴性的胎牛血清稀释至500 倍，于-20 ℃可保存1 年。

A.1.2 犬细小病毒阴性血清的制备

犬细小病毒阴性血清，由抗原检测为阴性的胎牛血清制备而成，于-20 ℃可保存1 年。

A.2 抗体的制备

A.2.1 犬细小病毒单克隆抗体的制备

A.2.1.1 重组蛋白的表达

将犬细小病毒VP2 蛋白基因、SUMO 标签、His 标签串联，优化为大肠杆菌偏爱密码子序列，合

成了犬细小病毒VP2 蛋白融合表达目的基因序列，连接至pET-28a 原核表达载体构建重组质粒

pET-28a-VP2，经转化构建成基因工程菌pET-28a-VP2-BL21。通过异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷诱导

重组工程菌表达蛋白，并进行目的蛋白的提取纯化，用BCA 法测定纯化后蛋白的浓度。

A.2.1.2 单克隆抗体的制备

将制备得到的CPV 重组蛋白为免疫原，分4 次免疫BABL/c 小鼠。最后一次免疫3 天后进行细胞

融合，再通过ELISA 检测筛选杂交瘤细胞，将产生CPV 特异性抗体的杂交瘤细胞进行克隆化培养，将

杂交瘤细胞注射到BABL/c 小鼠腹腔内，收集腹水并纯化，得到CPV 特异性单克隆抗体，通过BCA 法

测定抗体浓度，抗体的浓度应不低于1 mg/mL，抗体纯度>90%，于-20 ℃可保存1 年。

A.2.2 兔免疫球蛋白G(兔IgG)的制备

将正常兔的血清通过Protein A Agarose 亲和层析分离纯化获得兔IgG，通过BCA 法测定抗体的浓

度，抗体的浓度应不低于1 mg/mL，抗体纯度>90%，于-20 ℃可保存1 年。

A.2.3 羊抗兔二抗的制备

用兔IgG 作为抗原，免疫山羊后，提取羊血清中的免疫球蛋白制成羊抗兔二抗，通过BCA 法测定

抗体的浓度，抗体的浓度应不低于1 mg/mL，抗体纯度>90%，于- 20 ℃可保存1 年。

A.3 荧光微球垫的制备

A.3.1 荧光微球的选择和准备

荧光微球按以下要求选择和准备：

a) 纳米粒度仪检测镧系荧光微球粒径200 nm ~ 320 nm，单分散系数PDI为<0.1。

b) 材质及表面基团为聚苯乙烯-羧基。

c) 最大激发光波长345 nm，最大发射光波长为614 nm。

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d) 镧系荧光微球液体避光保存，在2 ℃ ~ 8 ℃中呈乳白色，荧光颜色为橙色。

A.3.2 荧光微球标记抗体的制备

取 200 μL 含量为1 %的镧系(铕)荧光微球溶液，加入5 倍体积的硼酸盐缓冲液(0.05 mol/L，pH

8.5)，以12000 rpm 离心15 min，弃上清，重复洗涤2 次，将洗涤后的荧光微球重悬于1 mL 的硼酸盐

缓冲液中。加入10 mg/mL 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺溶液15μL 和10 mg/mL N-羟基琥珀酰亚

胺溶液30 μL 混匀，室温(15 ℃ ~ 25 ℃)活化30 min，12000 rpm 离心15 min，用1 mL 硼酸盐缓冲液

重悬后加入100 μg CPV 抗体，室温(15 ℃ ~ 25 ℃)避光震荡4 h，加入封闭液，4 ℃避光震荡8 h ~ 12

h，12000 rpm 离心15 min，弃上清，加入1 mL 硼酸盐缓冲液洗涤微球1 次，并重悬已标记的荧光微球，

混匀，2 ℃ ~ 8 ℃保存备用。

同上述步骤制备荧光微球标记羊抗兔二抗溶液，将荧光微球标记的CPV 抗体溶液和荧光微球标记

的羊抗兔二抗溶液以体积比为10:1 进行混合，2 ℃ ~ 8 ℃保存备用。

A.3.3 荧光微球垫的制备

将标记抗体的荧光微球溶液，用喷金点膜仪设置喷量为3 μL/cm，每张玻璃纤维素膜(10 cm × 30 cm)

以7 mm间隔喷涂，将喷好的荧光微球垫放置在干燥架上，置37 ℃(±2 ℃)干燥4 h ~ 5 h，烘干后剪切，

于4 ℃ ~ 30 ℃密封保存备用。

A.4 包被片材的制备

A.4.1 包被溶液的制备

A.4.1.1 质控线(C 线)包被溶液

将100 μg 的兔IgG 加入到200 μL 磷酸缓冲液(0.02 mol/L，pH 值为7.4)中，作为质控线(C 线)

包被膜溶液，2 ℃ ~ 8 ℃保存备用。

A.4.1.2 检测线(T 线)包被溶液

用磷酸盐缓冲液(0.02 mol/L，pH 值为7.4)将CPV 抗体稀释至2 mg/mL 作为检测线包被溶液，

置于棕色玻璃瓶中，2 ℃ ~ 8 ℃保存备用。

A.4.2 包被

将质控线包被溶液和检测线包被溶液装入喷金点膜仪，按1 μL/cm 划线量在硝酸纤维素膜上均匀划

出质控线(C 线)和检测线(T 线)。

A.4.3 干燥

将已划线的硝酸纤维素膜放置于干燥架上，37 ℃(±2 ℃)干燥2 h ~ 3 h，放入装有干燥剂的铝箔

袋内，封口，贴上标签，于4 ℃ ~ 30 ℃密封保存备用。

A.5 样品垫的制备

将20 cm × 30 cm 的玻璃纤维素膜平铺于洁净的玻璃平板上，将20 mL 样品垫处理液倒入玻璃纤

维素膜中央，用滚轮铺匀，37 ℃(±2 ℃)过夜干燥，用切条机将其裁切为2.5 cm×30 cm，于4 ℃ ~ 30 ℃

密封保存备用。

A.6 检测卡的制备

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A.6.1 制备环境

在室温(15 ℃ ~ 25 ℃)及湿度≤30 %RH 的洁净环境下，按照以下步骤组装检测卡。

A.6.2 贴条

依次按硝酸纤维素膜、吸水垫、荧光微球垫、样品垫的顺序将各中间制品粘贴于底板的各个位置上，

保证各个中间品在相邻处均有1 mm ~ 2 mm 层叠，使硝酸纤维素膜的检测线(T 线)靠近样品垫一侧，

质控线(C 线)靠近吸水垫一侧。

A.6.3 切条

在室温(15 ℃ ~ 25 ℃)及湿度≤30 %RH 条件下，将已组装好的荧光微球大板修剪整齐后，用切

条机将检验合格的半成品裁切为2.7mm(±0.1 mm)宽的试纸。

A.6.4 装卡

选取硝酸纤维素膜无划痕、无污染，边缘整齐的试纸，将试纸装入卡壳中，使用压卡机压卡后，将

单卡与干燥剂、滴管装入铝箔袋并封口。

A.6.5 贮藏

将包装完毕的检测卡放入2 ℃ ~ 8 ℃的环境中冷藏，有效期为7 个月。

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附 录 B

(资料性)

相关试剂的配制

B.1 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液

称取71.6 g 的Na2HPO4·12H2O 溶于1000 mL 纯化水中，配制出0.2M Na2HPO4。称取31.2 g 的

NaH2PO4·2H2O 溶于1000 mL 纯化水中，配制出0.2 M NaH2PO4。量取81 mL 的0.2M Na2HPO4 和19 mL

的0.2 M NaH2PO4，混匀后配制而成。

B.2 0.02 moL/L 磷酸盐缓冲液

量取100 mL 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液，加水稀释至1000 mL，即为0.02 mol/L 磷酸盐缓冲液。

B.3 样品稀释液

称取氯化钠8.8 g 和Proclin-300 500 μL，添加到1000 mL 0.02 mol/L 磷酸盐缓冲液中，混匀后分装，

置4 ℃ ~ 30 ℃保存。

B.4 硼酸盐缓冲液(0.05 moL/L，pH 值为8.5)

称取6.7 g 硼酸，13.4 g 硼砂(含10 个结晶水)，溶解于800 mL 纯化水，定容至1 L，调节pH 至

8.5。

B.5 封闭液

称取100 g BSA，加入1 L 纯化水溶解，2 ℃ ~ 8 ℃保存。

B.6 样品垫处理液

称取3.0 g BSA，10.0 g 聚乙二醇20000，10 mL 吐温-20，加入1 L 硼酸盐缓冲液中，2 ℃ ~ 8 ℃

保存。