T/CVMA 218-2025 猪伪狂犬病毒gE抗体化学发光免疫分析检测方法 ,该文件为pdf格式 ,请用户放心下载!
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资源简介
团体标准 T/CVMA 218-2025《猪伪狂犬病毒gE抗体化学发光免疫分析检测方法》主要内容总结
1. 标准概述
- 标准名称：猪伪狂犬病毒gE抗体化学发光免疫分析检测方法
- 归口单位：中国兽医协会
- 起草单位：包括青海省动物疫病预防控制中心、中国动物疫病预防控制中心等多家机构及企业。
- 适用范围：适用于检测猪血清中伪狂犬病毒gE抗体，用于疫病诊断和免疫监测。
2. 技术原理
- 竞争法化学发光技术：
- 包被抗原：猪伪狂犬病毒gE重组蛋白固定在发光板上。
- 竞争反应：待检样品中的gE抗体与酶标单克隆抗体竞争结合包被抗原。
- 信号检测：抗原-酶标抗体复合物催化发光底物产生光子，发光强度与gE抗体含量成反比。
- 定量分析：通过校准品曲线（四参数拟合，R²≥0.99）计算抗体剂量值（NCU）。
3. 关键试剂与材料
- 核心组分：
- gE重组蛋白（附录A）：通过大肠杆菌表达系统制备，纯度≥0.05 mg/mL。
- 酶标单克隆抗体：辣根过氧化物酶（HRP）标记的gE单抗。
- 包被板（附录B）：gE蛋白包被发光板，封闭后真空保存。
- 溶液配制（附录C）：
- 包被缓冲液（pH 9.6碳酸盐缓冲液）、封闭缓冲液（含BSA和蔗糖的PBS）、洗涤液（25×浓缩液）、校准品稀释液（含BSA的PBS）。
- 校准品：6个梯度（0、5、12、25、50、100 NCU），由阴性血清和阳性血清（中和效价1:512）稀释制成。
- 化学发光底物：
- 底物A（鲁米诺+羟基香豆素，Tris-HCl pH 8.0）
- 底物B（维生素C+氨基酸氧化酶，醋酸铵 pH 5.2）
4. 仪器与耗材
- 主要设备：化学发光免疫分析仪、37℃恒温培养箱、微量移液器（单道/多道）、96孔反应板等。
- 保存条件：试剂需2~8℃或-20℃保存，校准品避免反复冻融。
5. 样品处理
- 采集：按NY/T 541标准采集猪血清（2~3 mL血液，离心分离，无溶血）。
- 保存：2~8℃保存≤1周，长期需-20℃冷冻。
6. 检测步骤
- 加样：
- 校准品/待测血清（30 μL）与酶标单抗（60 μL）在稀释板混匀，转移75 μL至包被板。
- 温育：37℃孵育30分钟。
- 洗板：洗涤液冲洗3次，拍干。
- 发光反应：每孔加入底物A+B各50 μL，避光静置5分钟。
- 读值：15分钟内用化学发光仪检测发光值。
7. 结果判定
- 校准曲线：以校准品发光值拟合四参数曲线（Y=(a-b)/[1+(x/c)^b]+d），R²≥0.99有效。
- 判定标准：
- 阴性：抗体剂量值<20 NCU。
- 阳性：抗体剂量值≥20 NCU。
8. 附录内容
- 附录A：gE重组蛋白制备流程（基因克隆、诱导表达、SDS-PAGE验证）。
- 附录B：包被板制备（包被、封闭、干燥、真空保存）。
- 附录C：所有试剂的详细配制方法及保存条件。
9. 其他说明
- 专利声明：部分内容可能涉及专利，发布机构不承担识别责任。
- 质量控制：试验需满足校准曲线拟合度要求，避免操作误差。
总结：该标准详细规范了猪伪狂犬gE抗体化学发光检测的全流程，从试剂制备、样品处理到结果判定，强调高灵敏度和定量分析的可靠性，适用于实验室标准化操作。
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