T/CVMA 179-2024 猫白血病病毒核酸检测方法

ICS 11.220
CCS B 41
团体标准
T/CVMA 179—2024
猫白血病病毒核酸检测方法
Nucleic acid detection method of feline leukemia virus
2024 - 9 - 9发布2024 - 9 - 9实施
中国兽医协会 发布

前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提出。
本文件由中国兽医协会归口。
本文件主要起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、上海基灵生物科技有限公司、东莞博盛生物科技有限公司、北京市动物疫病预防控制中心、北京动物园管理处、山东省动物疫病预防与控制中心、潍坊市动物疫病预防控制中心、上海市动物疫病预防控制中心、广州源博医药科技有限公司、天津农垦康嘉生态养殖有限公司。
本文件主要起草人：梁瑞英、梁琳、汤新明、丁家波、朱旭、王弋、刘昕、张启龙、贾婷、金红岩、刘存、刘砚涵、孙燕、赵洪进、赖强。

T/CVMA 179—2024
1
猫白血病病毒核酸检测方法
1 范围
本文件规定了猫白血病病毒核酸的PCR和荧光PCR的检测方法。
本文件适用于猫白血病病毒感染猫的血液中病毒核酸检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB19489 实验室生物安全通用要求
GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫
NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
FeLV：猫白血病病毒（Feline leukaemia virus）
RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）
TAE缓冲液：三羟甲基氨基甲烷_乙酸_乙二胺四乙酸（Tris Acetate-EDTA buffer）
TBE缓冲液：三羟甲基氨基甲烷_硼酸_乙二胺四乙酸（Tris-Borate-EDTA buffer）
Taq酶：耐热DNA聚合酶（Thermus Aquaticus Polymerase）
5 仪器和试剂
5.1 仪器
5.1.1 PCR扩增仪。
5.1.2 4 ℃离心机。
5.1.3 分析天平。
T/CVMA 179—2024
2
5.1.4 生物安全柜。
5.1.5 微波炉。
5.1.6 电泳仪。
5.1.7 荧光定量PCR仪。
5.1.8 电泳槽。
5.1.9 紫外凝胶成像仪。
5.1.10 移液器（2.5 μL、10 μL、100 μL、1000 μL）。
5.2 耗材
5.2.1 称量纸。
5.2.2 量筒。
5.2.3 锥形瓶。
5.2.4 一次性无RNase枪头（2.5 μL、10 μL、100 μL、1000 μL）。
5.2.5 无RNase离心管（1.5 mL）。
5.2.6 荧光定量PCR扩增仪配套的PCR管（0.2 mL）。
5.2.7 离心管（1.5 mL、200 μL）。
5.2.8 移液器吸头（2.5 μL、10 μL、100 μL）。
5.3 试剂
5.3.1 RNA提取试剂。
5.3.2 TAE电泳缓冲液：配方见附录A.1。
5.3.3 TBE电泳缓冲液：配方见附录A.2。
5.3.4 引物及探针序列，见附录B.1和C.1。
5.3.5 PCR阳性对照质粒序列、荧光PCR阳性对照质粒序列及制备，见附录D.1、D.2和D.3。
6 检测方法
6.1 样品采集、保存与运输
6.1.1 使用含ETDA抗凝剂的采血管，从临床疑似病例猫的前肢皮下头静脉或后肢的股静脉或耳缘静脉采集200~300 μL血液。样品编号并填写相应采样单，样品尽快送检，送检时添加冰袋，保持低温。
6.1.2 用于病毒核酸检测的样品应尽快送检，可在24 h之内检测的样本可置于4℃保存，24 h内无法检测的样本置于-70℃或以下保存，如无-70℃保存条件，则于-20℃冰箱保存。
T/CVMA 179—2024
3
6.2 样品处理
将6.1.1采集的肛拭子或粪便保存液，4℃，2000 g离心10 min，取200 μL上清液进行核酸提取。
6.3 核酸提取
6.3.1 提取样品总RNA，可采用本标准推荐的方法，或选择商业试剂盒，按照试剂说明进行。
6.3.2 取200 μL样品加入1 mL Trizol裂解液，剧烈振荡30 s，静置5 min。
6.3.3 每个样品管加200 μL三氯甲烷，振荡20 s，4℃ 10 000g离心10 min。
6.3.4 转移6.3.3中的600 μL上清液至新离心管，加等体积的异丙醇，混匀后4℃静置10 min，4℃ 10000 g离心10 min。
6.3.5 弃上清液，沉淀中加1 mL 75%乙醇，4℃ 10000 g离心10 min，弃上清，留沉淀，将离心管倒置于吸水纸上干燥。
6.3.6 将离心管中RNA沉淀用10 μL DEPC水充分溶解。
6.4 PCR检测方法
6.4.1 反转录
选用商品化的反转录试剂盒，按照试剂盒说明，将提取的RNA反转录为cDNA，cDNA直接用于PCR检测或者置于-20℃保存备用。
6.4.2 PCR扩增
取6.4.1步骤反转录的cDNA，进行PCR扩增检测，PCR反应体系及参数见附录B.2和B.3。
6.4.3 电泳检测
6.4.3.1 样品制备：分别取样品PCR扩增产物、阴/阳性对照扩增产物8 μL与2 μL 5×上样缓冲液混合均匀，加入核酸凝胶样品孔，核酸凝胶配置见附录A3。
6.4.3.2 加样：分别取10 μL DNA Marker、PCR扩增产物、阴、阳性对照扩增产物，加入凝胶孔。
6.4.3.3 电泳：5 V/cm 恒压下电泳30 min ，将凝胶置于凝胶成像系统中观察结果。
6.4.4 有效原则
6.4.4.1 阳性对照：PCR产物有495 bp的特异性核酸条带。
6.4.4.2 阴性对照：PCR产物无核酸条带。
6.4.4.3 6.4.4.1和6.4.4.2在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新检测。
6.4.5 结果判定
在实验有效的前提下，被检样品的PCR产物电泳后在495 bp位置出现特异性条带，判定为猫白血病病毒核酸阳性，否则判定为阴性。
6.5 荧光PCR检测方法
T/CVMA 179—2024
4
6.5.1 荧光PCR扩增试剂的准备与配制
配备荧光定量PCR扩增试剂，根据被检样品数量，按照推荐的反应液配方（见附录C.2）配制反应液，充分混合均匀后分装，每个反应管15 μL。
6.5.2 加样
将6.5.1配好的反应管中分别加入6.4.1中制备的cDNA溶液2 μL（约500 ng），使每管总体积达到20 μL，同时设立阴阳性对照孔，记录反应管对应的样品编号，盖紧管盖后，500 g离心30 s。
6.5.3 荧光PCR反应设定
将6.5.2中加样后的反应管放入荧光定量PCR仪内，编辑样品表后，选定与探针标记荧光基团相符合的检测通道读取荧光信号值，淬灭基团选择none。推荐的荧光PCR反应参数见C.3。
6.5.4 结果判定
6.5.4.1 确定阈值
读取检测结果，阈值设定原则以大于样本荧光背景值，并超过阴性对照扩增曲线的最高值为标准，可根据不同仪器噪声进行调整。
6.5.4.2 质控标准
阴性对照无特异性扩增曲线，阳性对照为典型的“S”型扩增曲线，且Ct值≤30。
6.5.4.3 阳性
若被检样品在相应通道Ct值＜35且出现特异性扩增曲线，判定被检样品猫白血病病毒核酸阳性。
6.5.4.4 阴性
若被检样品在相应通道无Ct值或Ct值＞38，判定被检样品猫白血病病毒核酸阴性。
6.5.4.5 可疑
被检样品在相应通道35≤Ct值≤38时，且出现特异性扩增曲线，建议对该样品进行重复试验，重复试验结果Ct 值≤38，扩增曲线有明显起峰，则判为猫白血病病毒核酸阳性；无Ct值或Ct值＞38，判定被检样品猫白血病病毒核酸阴性。
T/CVMA 179—2024
5
附 录 A （资料性） 试剂配方
A.1 5×TAE电泳缓冲液
称量Tris 24.2 g，Na2EDTA·2H2O 3.72 g于1 L烧杯中。向烧杯中加入约600 mL无菌蒸馏水，充分搅拌溶解；加入5.71 mL的冰乙酸，充分搅拌；加无菌蒸馏水定容至1 L后，室温保存。使用时稀释5倍即1×TAE。
A.2 5×TBE电泳缓冲液
称量Tris 54.0 g，EDTA 2.9 mg于1 L烧杯中。向烧杯中加入约600 mL 无菌蒸馏水，充分搅拌溶解；加入硼酸27.5 g，充分搅拌；加无菌蒸馏水定容至1 L后，室温保存。使用时稀释5倍即1×TBE。
A.3 核酸凝胶制备
取1.0 g 琼脂糖加入100 mL 1×TAE中加热至沸腾，充分溶化后冷却至50 ℃左右，加入核酸染色剂10 μL，混匀后倒入胶槽制备凝胶，凝固后置入电泳槽，加入1×TBE 核酸电泳缓冲液。
T/CVMA 179—2024
6
附 录 B （资料性） PCR引物序列、反应体系和参数
B.1 PCR引物序列
PCR扩增引物名称与序列见表B.1。
表B.1 PCR引物、探针的名称与序列
引物名称
扩增基因
引物序列 5’-3’
Pol_F
Pol
TGAATGTCCCTACCCGTT
Pol_R
GGATGGATGTCCTCTACCC
注1：引物由生物公司合成，纯度为HPLC级，用DEPC水溶解并稀释至终浓度10 μmol/L，-20℃保存备用。
注2：扩增目的片段长度495 bp，针对FeLV pol基因。
B.2 PCR检测反应体系
PCR检测反应体系见表B.2。
表B.2 PCR检测反应体系
B.3 PCR反应参数
PCR反应参数见表B.3。
表B.3 PCR反应参数
反应温度 (℃)
反应时间
循环数
95
3 min
1
95
10 s
35
56
30 s
72
45 s
72
5 min
1
试剂
工作液终浓度（μmol/L）
体积（μL）
2×Taq酶
\
10
Pol_F
0.5
0.5
Pol_R
0.5
0.5
待检核酸
\
2
灭菌去离子水
\
7
总体积
\
20
T/CVMA 179—2024
7
附 录 C （资料性） 荧光PCR引物序列、反应体系和参数
C.1 荧光PCR引物序列
荧光PCR引物、探针的名称与序列见表C.1。
表C.1 荧光PCR引物、探针的名称与序列
引物名称
扩增基因
引物序列 5’-3’
gag_F
gag
AACAGCAGAAGTTTCAAGGCC
gag_R
TTATAGCAGAAAGCGCGCG
Probe
FAM-CCAGCAGTCTCCAGGCTCCCCA-BHQ1
注1：引物由生物公司合成，纯度为HPLC级，用DEPC水溶解并稀释至终浓度10 μmol/L，-20℃保存备用。
注2：引物及探针是参考gag基因合成。
C.2 荧光PCR检测反应体系
荧光PCR检测反应体系见表C.2。
表C.2 荧光PCR检测反应体系
C.3 荧光PCR反应参数
荧光PCR反应参数见表C.3。
表C.3 荧光PCR反应参数
反应温度 (℃)
反应时间
循环数
45
15 min
1
95
2 min
1
95
15 s
40
60
60 s
试剂
终浓度（μmol/L）
体积（μL）
2×RT缓冲液
\
10
酶
\
0.5
gag_F
0.48
0.4
gag_R
0.48
0.4
Probe
0.16
0.8
待检核酸
\
2
灭菌水
\
5.9
总体积
\
20
T/CVMA 179—2024
8
附 录 D （资料性） FeLV阳性对照质粒的制备
D.1 FeLV PCR阳性对照质粒序列（GenBank Accession No. L06140.1）
5’-TGAATGTCCCTACCCGTTATTAGGGAGAGACCTATTAACCAAACTCAAGGCTCAGATCCATTTCACCGGGGAAGGAGCTAATGTTGTTGGACCCATGGGCTCACCCCTACAAGTCCTCACCTTGCAATAGAAGAAGAGTATCGGCTATTTGAGCCGAAAAGTGAACTGAAACAAGGTATGGACAGTTGGCTTAAAAACTTTCCCCGGGCATGGGCAGAAACAGGAGGTATGGGAATGGCTCATTGCCAAGCCCCATCCTCATTCAACTTAAAGCTACTGCCACCCCAATCTCCATTCGGCAGTACCCCATGCCCCATGAAGCTTACCAAGGAATTAAACCCCATATAAGGAGAATGCTGGACCAAGGCATCCTCAAGCCCTCCGGTCCCCATGGAATACACCCCTATTACCTGTCAAAAAGCCAGGAACCGGGGATTACCGACCAGTGCAGGACTTAAGAGAAGTAAATAAAAGGGTAGAGGACATCCATCC-3’
注：斜体加粗为PCR扩增引物。D.2 FeLV 荧光PCR阳性对照质粒序列（GenBank Accession No. MT229957.1）
5’-AACAGCAGAAGTTTTCAAGGCCGCTACCAACAGCAGAAGTTTCAAGGCGCTACCAGCAGTCTCCAGGCTCCCCAGTTGACCAGAGTTCGACCTTCCGCCTCATTTAAACTAACCAATCCCCACGCCTTCGCTTCTGTACGCGCGCTTTCTGCTATAA-3’
注：斜体加粗为荧光定量PCR扩增引物和探针。
D.3 阳性对照重组质粒的制备
按照D.1和D.2中的序列合成基因片段，分别克隆至pMD19-T 载体，再转化至DH5α 感受态细胞，分别构建FeLV PCR和荧光PCR阳性对照重组质粒，提取重组质粒进行PCR检测和测序分析，结果正确的为阳性重组质粒。利用超微量分光光度计测定阳性重组质粒浓度，并将浓度换算成拷贝数（DNA拷贝/μL=[6.02×1023×DNA浓度（ng/μL）×10-9]/（DNA碱基数×660）），即为FeLV PCR和荧光PCR阳性对照母液。将阳性对照母液10倍系列稀释之后，均选取104拷贝/μL稀释度作为阳性对照。