T/CVMA 178-2024 犬和猫细小病毒PCR检测方法

ICS 11.220
CCS B 41
团体标准
T/CVMA 178—2024
犬和猫细小病毒PCR检测方法
PCR detection method of canine and feline parvovirus
2024 - 9 - 9发布2024 - 9 - 9实施
中国兽医协会 发布

前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提出。
本文件由中国兽医协会归口。
本文件主要起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、上海基灵生物科技有限公司、东莞博盛生物科技有限公司、北京市动物疫病预防控制中心、山东合润检测技术有限公司、上海市动物疫病预防控制中心、广州源博医药科技有限公司、江苏农牧科技职业学院。
本文件主要起草人：梁瑞英、梁琳、汤新明、丁家波、侯绍华、朱旭、王弋、刘昕、张启龙、孙振、赖强、赵洪进、郝福星。

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犬和猫细小病毒PCR检测方法
1 范围
本文件规定了检测犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒（又称猫细小病毒）的通用PCR方法。
本文件适用于感染犬细小病毒或猫细小病毒的犬或猫粪便、肛拭子、EDTA血液样品的检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB19489 实验室生物安全通用要求
GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫
NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CPV：犬细小病毒（Canine Parvovirus）
FPV：猫细小病毒（Feline Parvovirus）
PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）
SDS：十二烷基硫酸（sodium dodecyl sulfate）
dNTP：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）
Tris：三羟甲基氨基甲烷（tris hydroxymethyl aminomethane）
TAE缓冲液：三羟甲基氨基甲烷_乙酸_乙二胺四乙酸（Tris Acetate-EDTA buffer）
TBE缓冲液：三羟甲基氨基甲烷_硼酸_乙二胺四乙酸（Tris-Borate-EDTA buffer）
Taq酶：耐热DNA聚合酶（Thermus Aquaticus Polymerase）
5 主要仪器
5.1 冰箱。
5.2 台式离心机。
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5.3 高速台式冷冻离心机。
5.4 高压蒸汽灭菌器。
5.5 PCR仪。
5.6 单道微量移液器（0.1-2.5 μL，0.5-10 μL，1-100 μL，1-1000 μL）。
5.7 电泳仪。
5.8 电泳槽。
5.9 凝胶成像仪。
6 试剂和材料
6.1 试验用水均为灭菌超纯水，应符合GB/T 6682中一级水的要求。
6.2 医用棉拭子、枪头（10 μL，200 μL，1000 μL）。
6.3 1.5 mL EP管。
6.4 0.2 mL PCR管。
6.5 dNTP（含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各10 mmol/L，-20 ℃保存。）。
6.6 10%十二烷基硫酸钠：配制参见附录A.1。
6.7 蛋白酶K贮备液：配制参见附录A.2。
6.8 5×TAE电泳缓冲液：配制参见附录A.3。
6.9 5×TBE电泳缓冲液：配制参见附录A.4。
6.10 PBS 配方：配制参见附录A.5。
6.11 PCR检测引物序列及反应液配方见附录B.1和B.2。
6.12 阳性对照的制备见附录C。
7 实验步骤
7.1 样品采集、保存与运输
7.1.1 样品采集
将无菌棉拭子用灭菌生理盐水充分浸润、采集肛拭子或粪便，将采集后拭子放入已装好病毒保存液的商品化样本收集管（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液），折断手柄，随即密封，即完成取样，编号并填写相应采样单，样品尽快送检，送检时添加冰袋，保持低温。
7.1.2 样品的保存与运输
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用于病毒核酸检测的样品应尽快送检，可在24 h之内检测的样本可置于4 ℃保存，24 h内无法检测的样本置于-70 ℃或以下保存，如无-70 ℃保存条件，则于-20 ℃冰箱保存。
7.1.3 样品处理
将7.1.2收集的肛拭子或粪便保存液，4℃，2000 g离心10 min，取200 μL上清液进行核酸提取。
7.2 细小病毒DNA的提取
7.2.1 取200 μL 7.1.3的样品处理液，加人25 μL 10%SDS和10 μL的20 mg/mL蛋白酶K，56℃孵育2 h。
7.2.2 放置室温，加入等量的饱和酚溶液500 μL，振荡混匀20 s，10000 g离心5 min，取上清液。
7.2.3 加入等量的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），振荡混匀20 s，10000 g离心5 min，离心5 min，取上清液。
7.2.4 再加入等量的氯仿:异戊醇（24:1），振荡混匀20 s，10000 g离心5 min，离心5 min，取上清液。
7.2.5 加入两倍体积的预冷无水乙醇，上下颠倒混匀，10000 g离心10 min，弃上清。
7.2.6 室温干燥后，加人30 μL RNase-free水溶解沉淀，即得DNA模板，-20℃贮存备用。
7.2.7 可采用同等提取效果的其他方法或商品化病毒核酸提取试剂盒。
7.3 PCR扩增
取7.2步骤提取的病毒核酸，进行PCR扩增检测，PCR扩增引物序列、反应体系及反应参数见附录B。
7.4 扩增产物电泳检测
7.4.1 样品制备：分别取样品PCR 扩增产物、阴/阳性对照扩增产物8 μL与2 μL 5×上样缓冲液混合均匀，加入核酸凝胶样品孔，核酸凝胶配置见附录A.6。
7.4.2 加样：分别取10 μL DNA Marker、PCR扩增产物、阴、阳性对照扩增产物，加入凝胶孔。
7.4.3 电泳：5 V/cm恒压下电泳30 min，将凝胶置于凝胶成像系统中观察结果。
7.5 有效原则
7.5.1 阳性对照：PCR产物有768 bp的特异性核酸条带。
7.5.2 阴性对照：PCR产物无核酸条带。
7.5.3 7.5.1和7.5.2在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新检测。
7.6 结果判定
在实验有效的前提下，被检样品的PCR产物电泳后在768 bp位置出现特异性条带，判定为细小病毒核酸阳性，否则判定为阴性。
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附 录 A （资料性） 试剂配方
A.1 10% SDS
在45 mL 无菌蒸馏水溶解5 g SDS（电泳级），加热至60 ℃溶解，用盐酸调pH值至7.8，加无菌蒸馏水定容至50 mL。
A.2 蛋白酶K贮备液（20 mg/mL)
每升无菌蒸馏水中加入Tris 1.21 mg，EDTA 1.86 mg，SDS 5 g，用盐酸调pH值至7.8。取该溶液按每毫升加入20 mg蛋白酶K，充分溶解后分装。
A.3 5×TAE电泳缓冲液
称量Tris 24.2 g，Na2EDTA·2H2O 3.72 g于1 L烧杯中。向烧杯中加入约600 mL无菌蒸馏水，充分搅拌溶解；加入5.71 mL的冰乙酸，充分搅拌；加无菌蒸馏水定容至1 L后，室温保存。使用时稀释5倍即1×TAE。
A.4 5×TBE电泳缓冲液
称量Tris 54.0 g，EDTA 2.9 mg于1 L烧杯中。向烧杯中加入约600 mL 无菌蒸馏水，充分搅拌溶解；加入硼酸27.5 g，充分搅拌；加无菌蒸馏水定容至1 L后，室温保存。使用时稀释5倍即1×TBE。
A.5 pH7.2，0.01 mol/L PBS的配制
A.5.1 25×PB的配制
称量2.74 g磷酸氢二钠和0.79 g磷酸二氢钠，加蒸馏水溶解，最后定容至100 mL。
A.5.2 1×PBS的配制
量取40mL 25×PB，加入8.5 g氯化钠，加蒸馏水，最后定容至1000 mL。
A.5.3 pH7.2，0.01 mol/L PBS的配制
取1×PBS，用氢氧化钠或盐酸调pH至7.2，灭菌或过滤除菌，PBS一经使用，于4℃保存不应超过3周。
A.6 核酸凝胶制备
取1.0 g 琼脂糖加入100 mL 1×TAE中加热至沸腾，充分溶化后冷却至50 ℃左右，加入核酸染色剂10 μL，混匀后倒入胶槽制备凝胶，凝固后置入电泳槽，加入1×TBE 核酸电泳缓冲液。
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附 录 B （资料性） PCR引物序列、反应体系和参数
B.1 PCR引物序列
细小病毒核酸PCR通用引物序列见表B.1。
表B.1 细小病毒核酸PCR通用引物序列
引物名称
扩增片段（bp）
引物序列 5’-3’
上游引物
768
CTTTGCCTCAATCTGAAGGAG
下游引物
AATTGGATTCCAAGTATGAGAG
注：引物由生物公司合成，纯度为HPLC级，用DEPC水溶解并稀释至终浓度10 μmol/L, -20℃保存备用。
B.2 PCR检测反应体系
细小病毒PCR检测反应体系见表B.2。
表B.2 细小病毒PCR检测反应体系
B.3 PCR反应参数
细小病毒PCR反应参数见表B.3。
表B.3 细小病毒PCR反应参数
反应温度 (℃)
反应时间
循环数
95
5 min
1
95
30 s
30
55
30 s
72
45 s
72
5 min
1
试剂
终浓度（μmol/L）
体积（μL）
2×Taq酶
\
10
上游引物
0.5
0.5
下游引物
0.5
0.5
待检核酸
\
2
灭菌去离子水
\
7
总体积
\
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附 录 C （资料性） 细小病毒阳性对照质粒的制备
C.1 细小病毒阳性对照质粒序列（CPV GenBank Accession No. MW679572.1、FPV GenBank Accession No. FJ231389.1）
5’-CTTTGCCTCAATCTGAAGGAGATATTAACTTTGGTGATATAGGAGTTCAACAAGATAAAAGACGTGGTTTAACTCAAATGGGAAATACAAACTATATTACTGAAGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAGGCGTCTACACAAGGGCCATTTAAAACACCTATTGCAGCAGGACGGGGGGGAGCGCAAACAGATGAAAATCAAGCAGCAGATGGTAATCCAAGATTGCATTTGGTAGACAACATGGTCAAAAAACTACCACAACAGGAGAAACACCTGAGAGATTTACATATATAGCACATCAAGATACAGGAAGATATCCAGAAGGAGATTGGATTCAAAATATTAACTTTACCTTCCTGTAACAAATGATAATGTATTGCTACCAACAGATCCAATTGGAGGTAAAACAGGAATTAACTATACTAATATATTTAATACTTATGGTCCTTTAACTGCATTAAATAATGTACCACCAGTTATCCAAATGGTCAAATTTGGGATAAAGAATTTGATACTGACTTAAAACCAAGACTTCATGTAAATGCACCATTTGTTTGTCAAAATAATTGTCCTGGTCAATTATTTGTAAAAGTTGCGCCTAATTAACGAATGAATATGATCCTGATGCATCTGCTAATATGTCAAGAATTGTAACTTACTCAGATTTTTGGTGGAAAGGTAAATTAGTATTTAAAGCTAAACTAAGAGCCTCTCATACTTGGAATCCAATT3’
注：斜体加粗为PCR扩增引物。
C.2 阳性对照重组质粒的制备
按照C.1中的序列合成基因片段，并克隆至pMD19-T 载体，再转化至DH5α 感受态细胞，构建重组质粒，提取重组质粒进行PCR检测和测序分析，鉴定为阳性重组质粒。利用超微量分光光度计测定阳性重组质粒浓度，并将浓度换算成拷贝数（DNA拷贝/μL=[6.02×1023×DNA浓度（ng/μL）×10-9]/（DNA碱基数×660）），即为细小病毒阳性对照母液。将阳性对照母液10倍系列稀释之后，选取104拷贝/μL稀释度作为阳性对照。