ICS 67.180.10
CCS B47 GH
中 华 人 民 共 和 国 供 销 合 作 行 业 标 准
GH/T 1532—2026
蜂蜜中薰衣草源成分的检测
实时荧光 PCR 法
Identification of lavander derived ingredients in honey — real-time PCR method
2026 - 03 - 19 发布 2026 – 07 – 01 实施
中华全国供销合作总社 发 布
前 言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华全国供销合作总社提出。
本文件由全国蜂产品标准化技术委员会(SAC/TC601)归口。
本文件起草单位：中国计量大学、南京海关动植物与食品检测中心、中国蜂产品协会、杭州市生态环境局临安分局、郑州师范学院、河南科技学院、中国质量检验检测科学研究院、山东蜜源蜂业有限公司、北屯市新原养蜂农民专业合作社、伊犁伊阳蜂业有限公司。
本文件主要起草人：李红亮、文嘉琪、杨雪梅、王毅谦、吴帆、谭丽蕊、王宏、王林青、王国昌、张紫娟、杨艳歌、苏昌鹏、安传远、周莲。
蜂蜜中薰衣草源成分的检测 实时荧光 PCR 法
1 范围
本文件规定了蜂蜜中薰衣草源成分的实时荧光PCR检测方法。
本文件适用于蜂蜜中薰衣草源成分的定性检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27403-2018 实验室质量控制规范 食品分子生物学检
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3. 1
薰衣草 lavender
薰衣草(Lavandula angustifolia Mill.)，唇形花科、薰衣草属的多年生常绿小灌木。薰衣草普遍夏秋季开花，为穗状花序，花序长 5~ 15 cm ，花色因品种而异有蓝，淡紫，紫，浓紫及白色等，以蓝紫色最普遍。
3.2
薰衣草源成分 lavender derived ingredients
是指含有薰衣草属(Lavandula)植物来源的物质，并保留其特征性核酸序列。
3.3
实时荧光 PCR real-time PCR
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现对起始模板的定量及定性分析。
3.4
循环阈值 cycle threshold
每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
Ct：循环阈值(Cycle threshold)
CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethylammonium bromide)
DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid)
EDTA：乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid)
FAM：羧基荧光素(Fluorescein 5-carboxylic acid)
ITS2： 内转录间隔区 2(Internal transcribed spacer 2)
NADH：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原型辅酶 I)[Nicotinamide Adenine Dinucleotide (reduced form)]
OD260/280：260 nm/280 nm 光密度值(Optical density)
PCR：聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)
Real-time PCR：实时荧光聚合酶链式反应(Real-time polymerase chain reaction)
TAMRA：羧基四甲基罗丹明(5-Carboxytetramethylrhodamine)
Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)aminomethane]
5 原理
从蜂蜜样品中提取 DNA ，进行实时荧光 qPCR 反应。通过荧光信号是否对数增长而判断扩增是否成功，再通过扩增获得的 Ct 值大小，判定是否含有薰衣草源成分。
6 仪器设备
6.1 实时荧光 PCR 扩增仪
6.2 高速冷冻离心机 (≥ 12000 r/min)
6.3 超微量紫外可见分光光度计
6.4 高压灭菌锅
6.5 恒温水浴锅
6.6 分析天平：感量 0. 1 mg
6.7 pH 计
6.8 微量移液器：量程 0. 1 µL~2.5 µL, 0.5 µL~ 10 µL，2 µL~20 µL，20 µL~200 µL, 200 µL~ 1000 µL。
7 试剂和材料
7.1 目标基因引物(薰衣草 ITS2 基因)
7.1.1 上游引物 F：5’-GCAGCGTTCGGGCTTAACTCACC-3 ’
7.1.2 下游引物 R：5’-CAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTT-3 ’
7.1.3 荧光探针 P：FAM-5’-GGGCAGCGGGCGTCTATCGAATGTCA-3’-TAMRA
7.2 内参引物(显花植物 NADH 基因引物)
7.2.1 上游引物 F：5’-GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA-3 ’
7.2.2 下游引物 R：5’-AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA-3 ’
7.2.3 荧光探针 P：FAM-5’-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-3’-TAMRA
7.3 对照样品
7.3.1 阴性对照：非薰衣草植物 DNA(如油菜、党参、茶等)。
7.3.2 阳性对照：薰衣草 DNA。
7.3.3 空白对照：实时荧光 PCR 反应时以水代替扩增 DNA 模板。
7.4 试剂
除非另有规定，本文件中所用试剂均为分析纯，水应符合 GB/T 6682 一级水的规定。
7.4.1 适合荧光探针法的实时荧光 PCR 反应试剂(2×)
7.4.2 实时荧光 PCR 专用参比染料(50×)
7.4.3 CTAB 裂解缓冲液和提取缓冲液(配制方法分别见附录 A. 1 与 A.2)
7.4.4 亚硫酸氢钠(Sodium disulphite)
7.4.5 聚乙烯吡咯烷酮-40(PVP-40)
7.4.6 5%十二烷基肌氨酸钠(配制方法见附录 A.3)
7.4.7 氯仿/异戊醇(体积比 24:1)
7.4.8 异丙醇(-20 ℃预冷)
7.4.9 70% 乙醇(体积比)
7.4.10 三羟甲基氨基甲烷(Tris)
7.4.11 乙二胺四乙酸(EDTA)
7.4.12 氯化钠(NaCl)
7.4.13 浓盐酸(HCl)
7.4.14 氢氧化钠(NaOH)
7.4.15 山梨醇(Sorbitol)
7.5 提取工作液准备
分别吸取 41.7 mL CTAB 裂解缓冲液(7.4.3)和提取缓冲液(7.4.3)，再依次加入 0.5 g 亚硫酸氢钠和 2 g
聚乙烯吡咯烷酮-40 ，充分振荡混匀，用 5%十二烷基肌氨酸钠定容至 100 mL 。工作液需现用现配。
8 试样制备和保存
对无结晶的蜂蜜样品，将其搅拌均匀;对有结晶的样品，在密闭的情况下，置于不超过60 ℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅拌，冷却至室温。分出200 g作为试样，置于样品瓶中，密封，并做上标记。室温下保存。
9 操作程序
9.1 样品处理和 DNA 提取
9.1.1 称取 25 g 蜂蜜样品至 50 mL 离心管中，加入 30 mL 水，振荡混匀。于 4 ℃ 、8000 r/min 下离心
25 min。
9.1.2 弃上清液，加入于 1 mL 现配的工作液(见 7.5)。充分混匀后，于 37 ℃水浴 12~ 16 h。
9.1.3 向样品中加入 1 mL 氯仿/异戊醇(体积比 24:1) ，缓慢颠倒混匀 10 min ，于 12000 r/min 离心
10 min。
9.1.4 转移上清至新离心管中，加入等体积-20 ℃预冷的异丙醇。12000 r/min 离心 10 min。
9.1.5 弃上清，DNA 位于沉淀中，加入 500 μL 70%乙醇溶液洗涤沉淀，12000 r/min 离心 5 min。
9.1.6 弃去乙醇，室温晾干至乙醇完全挥发,加 50 μL 水溶解 DNA ，于–20 ℃保存。
9.2 提取 DNA 的浓度和 OD260/280 测定
吸取 1 μL DNA 提取液(步骤 9. 1.6)，利用超微量紫外可见分光光度计测定提取 DNA 样品的浓度
(单位为 ng/µL)和 OD260/280 数值(1.7~2.0 适宜 PCR 扩增)。
9.3 实时荧光 PCR 扩增
9.3.1 实时荧光 PCR 反应体系
实时荧光PCR反应体系按表1规定配制，检测过程中设置阳性对照、阴性对照和空白对照。配制反应液时应避免强光，且防止产生气泡。
表 1 实时荧光 PCR 反应体系配制表
9.3.2 实时荧光 PCR 反应参数
95 ℃预变性 30 s ，然后 95 ℃ 5 s 、60 ℃ 30 s ，45 个循环。反应参数和条件仅供参考，具体可根据
所用探针法 qPCR 试剂和实时荧光 PCR 仪操作说明书设置。
10 质量控制
实验结果满足以下全部条件时，方可判定为有效;任一条件不满足时，实验视为无效：
(1) 空白对照：无明显荧光对数增长，或扩增曲线无指数增长且 Ct 值≥40。
(2) 阳性对照：有荧光对数增长，且 Ct 值≤30。
(3) 内参基因：有荧光对数增长，且 Ct 值≤30。
(4) 阴性对照：无明显荧光对数增长，或扩增曲线无指数增长且Ct值≥40。
11 结果判断与表述
11.1 结果判定
在符合第 10 章质量控制要求的前提下，检测结果按如下规则判定：
(1) 样本有明显荧光对数增长期，且 Ct 值≤35 ，判定为阳性。
(2) 样本无明显荧光对数增长期，且 Ct 值≥40 ，判定为阴性。
(3) 样本有明显荧光对数增长期，且 35
次。重复实验后，若样本 Ct值<40 ，判定为阳性;Ct 值≥40 或无明显荧光对数增长期，判定为阴性。
11.2 结果表述
11.2.1 内参基因检测阴性，目标成分检测阴性，表述为“未提取到有效的植物 DNA 组分，本次检测结果无效 ”。
11.2.2 内参检测阳性， 目标成分检测阳性，表述为“检出薰衣草成分 ”。
11.2.3 内参检测阳性， 目标成分检测阴性，表述为“未检出薰衣草成分 ”。
12 检测过程中防止交叉污染的措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照 GB/T 27403-2018 中附录 D 的规定执行。
A
A
附 录 A
(资料性附录)
溶液的配制
A.1 CTAB 裂解缓冲液
裂解缓冲液(2% CTAB ，0.2 mol/L Tris•HCl pH 8.0 ，0.05 mol/L EDTA pH8.0 ，2 mol/L NaCl)
CTAB(7.3.3) 4 g
Tris(7.3. 10) 4.8 g
EDTA(7.3. 11) 2.9 g
NaCl(7.3. 12) 23.3 g
H2O溶解，用浓盐酸(7.3. 13)与NaOH(7.3. 14)将溶液pH调至8.0，并稀释至200 mL，高压灭菌后0~4℃
保存。
A.2 提取缓冲液
提取缓冲液(0.35 mol/L山梨醇，0. 1 mol/L Tris•HCl pH 8.0 ，0.005 mol/L EDTA pH8.0)
山梨醇(Sorbitol)(7.3. 15) 12.75 g
Tris(7.3. 10) 2.4 g
EDTA(7.3. 11) 0.29 g
H2O溶解，用浓盐酸(7.3. 13)与NaOH(7.3. 14)将溶液pH调至8.0，并稀释至200 mL，高压灭菌后0~4℃
保存。
A.3 5 %十二烷基肌氨酸钠
十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl stock) 5 g
H2O溶解，稀释至100 mL ，高压灭菌后0~4 ℃保存。
B
B
附 录 B
(资料性附录)
薰衣草源成分的基因扩增靶标参考序列(GenBank ID: MZ191051. 1, ITS2 基因)
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