T∕CAV 016-2025 二代测序法在灭活疫苗候选株筛选应用的技术要求 ,该文件为pdf格式 ,请用户放心下载!
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资源简介
《T/CAV 0162025 T/CAS 10492025 二代测序法在灭活疫苗候选株筛选应用的技术要求》的主要内容总结如下：
核心目标： 规范二代测序技术（NGS）在筛选灭活疫苗候选株及其种子批系统过程中的应用，主要针对外源因子污染检测和全基因组遗传稳定性评估两个方面。
适用范围：
- 适用于从病人样本中分离的天然灭活疫苗候选株的筛选。
- 不适用于经生物工程改造的疫苗候选株。
主要内容分章节详解：
- 利用宏基因组测序检测外源因子污染 (第4章)：
- 流程：
- 核酸提取： 按试剂盒操作，需设置阴性对照（病毒：细胞基质；细菌：培养基）。
- 文库构建： RNA需逆转录合成双链DNA，与DNA合并建库。
- 宏基因组测序： 在NGS平台上测序。
- 数据分析： 去低质序列后，比对数据库识别物种组成，评估污染。
- 丰度分析： 获取物种丰度值。
- 质量指标：
- 接头污染比例 ≤ 1%
- 序列有效长度 ≥ 50 bp
- 有效比对率 ≥ 70%
- 数据库要求：
- 需包含宿主、细菌、真菌、病毒、寄生虫、支原体、衣原体、立克次体等。
- 需评估数据库精准性并持续更新（来源：公共/商业/自建）。
- 污染评估标准：
- 除目标病原微生物外，任何外源因子（如支原体）的丰度值超过阴性对照相应丰度值一个数量级，判定为存在污染，候选株应排除。在同一个数量级可保留。
- 补充要求： 其他无菌和外源因子检测仍需符合《中国药典》三部。
- 流程：
- 利用NGS评估全基因组遗传稳定性 (第5章)：
- 流程：
- 核酸提取： 按试剂盒操作。
- 文库构建： RNA需逆转录合成双链DNA再建库；DNA直接建库。
- 全基因组测序： 在NGS平台上测序。
- 数据分析： 去低质序列后，比对目标病原微生物参考基因组，得到BAM文件，经去重、排序、拼接获得全基因组序列。
- 稳定性评估： 基于序列特征评估。
- 质量指标：
- 碱基识别质量 Q30 ≥ 85%
- 序列有效长度 ≥ 100 bp
- 测序覆盖度 ≥ 98%
- 测序深度：病毒候选株 ≥ 1000X；细菌候选株 ≥ 100X
- 稳定性评估标准：
- 筛选获得的候选株的全基因组分子遗传特征必须与目标病原微生物标准参考基因组序列一致。
- 补充要求： 其他遗传稳定性检测仍需符合《中国药典》三部。
- 流程：
- 种子批系统的特殊要求 (第6、7章)：
- 外源因子污染检测 (宏基因组，第6章)：
- 质量指标： 同候选株宏基因组要求（接头≤1%，长度≥50bp，比对率≥70%）。
- 数据库要求： 同候选株宏基因组要求（全面、评估、更新）。
- 污染评估标准： 同候选株宏基因组要求（外源因子丰度超阴性对照一个数量级即污染，应排除）。
- 补充要求： 其他无菌和外源因子检测仍需符合《中国药典》三部。
- 遗传稳定性评估 (NGS全基因组，第7章)：
- 质量指标 (更严格)：
- 碱基识别质量 Q30 ≥ 90%
- 序列有效长度 ≥ 100 bp
- 测序覆盖度 ≥ 99%
- 测序深度：病毒种子批各代次 ≥ 5000X；细菌种子批各代次 ≥ 500X
- 稳定性评估标准 (更综合)：
- 传代要求： 候选株基因组稳定后，主种子批起需连续传代至少5代以上。
- 序列一致性： 种子批系统内各代次间全基因组序列一致性 ≥ 99%。
- 变异频率稳定性： 与生物学功能相关基因位点的变异频率在各代次间需保持一致（统计检验p值 > 0.05）。
- 质量指标 (更严格)：
- 外源因子污染检测 (宏基因组，第6章)：
其他关键点：
- 规范性引用文件： 引用了GB/T（国标）、WS/T（卫生行标）等关于高通量测序数据格式、规程、菌毒种评价的标准，以及《中国药典》三部。
- 术语定义： 明确定义了疫苗候选株、种子批系统、测序深度、测序覆盖度、全基因组、宏基因组、碱基识别质量、有效序列长度等关键术语。
- 首次制定： 标准为首次制定，填补了该领域的技术标准空白。
- 起草单位： 由疾控中心、研究所、大学及多家知名疫苗企业（如科兴系、艾美、兴盟等）共同起草。
- 参考文献： 列出了相关的国家标准、行业标准、专家共识及药典。
总结：
该标准为利用二代测序技术高效、精准地筛选安全（无外源污染）且稳定（遗传稳定）的灭活疫苗候选株及其种子批系统，提供了一套详细、可操作的技术规范。它详细规定了从样本处理（核酸提取、建库）、测序操作、数据分析到结果判定的全流程要求，特别是针对宏基因组污染检测和全基因组稳定性评估的核心环节，设定了明确的质量控制指标和评估判定标准，并对疫苗种子批系统提出了更严格的要求。该标准的实施将提升灭活疫苗研发的质量和效率。
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