T/CVMA 247-2025 猪伪狂犬病病毒gE蛋白间接磁微粒 CLIA抗体检测方法

​​T/CVMA 247-2025《猪伪狂犬病病毒gE蛋白间接磁微粒CLIA抗体检测方法》主要内容总结​​

• ​​标准编号​​：T/CVMA 247-2025
• ​​标准名称​​：猪伪狂犬病病毒gE蛋白间接磁微粒CLIA抗体检测方法
• ​​适用范围​​：适用于猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体的检测。
• ​​归口单位​​：中国兽医协会
• ​​起草单位​​：兰州兽研生物科技有限公司、中国农业科学院兰州兽医研究所等多家机构。

• ​​GB/T 6682​​：分析实验室用水规格和试验方法
• ​​GB/T 18641​​：伪狂犬病诊断方法（用于校准品制备的参考方法）
• ​​NY/T 541​​：兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

• ​​方法​​：间接磁微粒化学发光免疫分析法（CLIA）
• ​​核心步骤​​：
  1. 磁微粒偶联gE蛋白作为固相载体，与样本中的抗体结合形成复合物。
  2. 碱性磷酸酶标记的兔抗猪IgG作为二抗，催化化学发光底物产生信号。
  3. 通过发光值（RLU）拟合四参数校准曲线，定量抗体浓度。

​​4.1 主要试剂​​

• ​​25×浓缩洗液​​：含丁二酸、氯化钠、吐温-20等（附录A.1）。
• ​​稀释液​​：磷酸盐缓冲体系（附录A.2）。
• ​​磁微粒工作液​​：偶联gE蛋白的磁微粒悬浮液。
• ​​酶标抗体工作液​​：碱性磷酸酶标记兔抗猪IgG。
• ​​校准品​​：6个梯度（0 U、10 U、20 U、40 U、80 U、320 U），通过高免血清稀释制备（附录B）。
• ​​质控品​​：2个水平（<15 U和40~65 U）（附录C）。
• ​​化学发光底物​​：用于信号检测。

​​4.2 仪器设备​​

• ​​全自动化学发光免疫分析仪​​（需磁微粒酶促化学发光功能）。
• 电子天平、离心机（16000 r/min）、移液器、离心管、反应杯等。

​​5.1 样本处理​​

• ​​采集​​：静脉采血≥2 mL，分离血清（NY/T 541）。
• ​​保存​​：短期（2~8℃），长期（-20℃以下）。
• ​​预处理​​：若有沉淀，需8000 r/min离心2 min。

​​5.2 检测步骤​​

1. ​​免疫反应​​：样本（20 μL） + 磁微粒工作液（25 μL） + 稀释液（55 μL），37℃孵育10 min。
2. ​​清洗​​：磁分离后弃上清，洗液清洗4次。
3. ​​酶反应​​：加入酶标抗体（100 μL），37℃孵育10 min。
4. ​​二次清洗​​：同步骤2。
5. ​​发光检测​​：加入底物（100 μL），37℃反应3 min，读取RLU值。

​​5.3 质控要求​​

• ​​质控频率​​：试剂变更或校准后、每24小时检测1次。
• ​​可接受范围​​：
  • 质控品1：<15 U
  • 质控品2：40~65 U

​​5.4 校准曲线拟合​​

• ​​方法​​：四参数公式（Y=(a-d)/[1+(x/c)^b]+d）。
• ​​校准品​​：6个梯度（0~320 U），R²需≥0.999（附录D）。

• ​​阳性​​：抗体含量≥35 U。
• ​​阴性​​：抗体含量<35 U。

• ​​附录A​​：试剂配方（洗液、稀释液、校准品稀释液）。
• ​​附录B​​：校准品制备（高免血清免疫流程及稀释标定）。
• ​​附录C​​：质控品制备（稀释至5 U和50 U）。
• ​​附录D​​：校准曲线实例（发光值范围及拟合示例）。

• ​​专利声明​​：部分内容可能涉及专利，发布机构不承担识别责任。
• ​​保存条件​​：校准品和质控品需-20℃保存，有效期36个月。
• ​​交叉引用​​：需结合GB/T 18641（ELISA方法）验证抗体水平。

​​总结​​：该标准详细规定了基于磁微粒CLIA技术检测猪伪狂犬病gE抗体的方法，涵盖试剂配制、仪器操作、质控流程及结果判定，适用于实验室精准定量检测。