T/CVMA 246-2025 猪繁殖与呼吸综合征病毒间接磁微粒 CLIA抗体检测方法

​​《猪繁殖与呼吸综合征病毒间接磁微粒CLIA抗体检测方法》（T/CVMA 246-2025）主要内容总结​​

• ​​标准性质​​：中国兽医协会（CVMA）发布的团体标准，规范猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体的间接磁微粒化学发光免疫分析法（CLIA）。
• ​​适用范围​​：适用于猪血清中PRRSV抗体的定量检测，用于疫病监测、免疫效果评估等。
• ​​技术原理​​：以磁微粒为载体，通过抗原-抗体结合形成复合物，利用碱性磷酸酶催化的化学发光反应放大信号，通过四参数拟合校准曲线计算抗体浓度（单位：U）。

​​2.1 试剂与配制​​

• ​​关键试剂​​：
  • ​​磁微粒工作液​​：偶联PRRSV N蛋白的磁微粒悬浮液。
  • ​​酶标抗体​​：碱性磷酸酶标记的兔抗猪IgG。
  • ​​校准品​​：6个梯度（0U、6.25U、25U、100U、400U、800U），用于建立标准曲线。
  • ​​质控品​​：质控品1（<20U）、质控品2（70~180U），用于实验有效性验证。
  • ​​化学发光底物​​：触发发光反应。
• ​​溶液配制​​：
  • ​​25×浓缩洗液​​：含丁二酸、氯化钠、吐温-20等（附录A.1）。
  • ​​体系稀释液​​：磷酸盐缓冲体系（附录A.2）。
  • ​​校准品稀释液​​：含牛血清白蛋白、海藻糖等保护剂（附录A.3）。

​​2.2 仪器与耗材​​

• ​​主要设备​​：
  • 全自动化学发光免疫分析仪（磁微粒酶促发光检测）。
  • 离心机（最高16000 r/min）、电子天平（精度0.1mg）、移液器等。
• ​​耗材​​：反应杯、试剂船、1.5/2 mL离心管等。

​​2.3 检测流程​​

1. ​​样本处理​​：
   • 采集猪血清（按NY/T 541标准），2~8℃短期保存，-20℃长期保存；含杂质时需离心（8000 r/min，2 min）。
2. ​​免疫反应​​：
   • 10 μL样本 + 25 μL磁微粒工作液 + 60 μL体系稀释液 → 37℃孵育5 min。
3. ​​清洗​​：磁分离弃上清，洗液清洗4次。
4. ​​酶反应​​：加入100 μL酶标抗体 → 37℃孵育10 min → 再次清洗。
5. ​​检测​​：加入100 μL发光底物 → 37℃反应3 min → 读取RLU值。
6. ​​计算​​：通过四参数校准曲线（公式：Y=(a-d)/[1+(x/c)^b]+d）计算抗体浓度。

​​2.4 质量控制​​

• ​​质控要求​​：
  • 每次试剂更换或校准后需检测质控品；质控品每24小时检测1次。
  • 质控品1（<20U）、质控品2（70~180U）结果在范围内实验有效。
• ​​校准曲线​​：
  • 6点校准品拟合四参数曲线，要求相关系数（r）≥0.9999（附录D）。

​​2.5 结果判定​​

• ​​阳性​​：抗体含量≥66 U。
• ​​阴性​​：抗体含量<66 U。

• ​​附录A​​：试剂配方（洗液、稀释液等）。
• ​​附录B​​：校准品制备流程（高免血清免疫、ELISA标定、梯度稀释）。
• ​​附录C​​：质控品制备及有效性验证（Mean±3SD）。
• ​​附录D​​：校准曲线实例（图D.1显示6点校准的RLU值与浓度对数线性关系）。

• ​​专利声明​​：标准可能涉及专利，发布机构不承担识别责任。
• ​​起草单位​​：兰州兽研生物科技、中国农科院兰州兽医所等多家机构联合制定。
• ​​有效期​​：校准品和质控品-20℃保存36个月内有效。

​​总结​​：该标准详细规定了PRRSV抗体CLIA检测的试剂、仪器、操作步骤、质控及判定标准，强调自动化、高灵敏度（化学发光）和标准化（四参数拟合），适用于兽医实验室的精准检测。