农业农村部公告 第864号-5-2024 转基因植物及其产品成分检测 抗虫耐除草剂玉米BFL4-2转化体特异性PCR方法 ,该文件为pdf格式 ,请用户放心下载!
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资源简介
中国国家标准《抗虫耐除草剂玉米BFL4-2转化体检测方法》主要内容总结
1. 标准概述
- 标准编号：农业农村部公告第864号一5一2024
- 名称：转基因植物及其产品成分检测抗虫耐除草剂玉米BFL4-2转化体特异性PCR方法
- 适用范围：适用于玉米及其制品中BFL4-2转化体成分的定性和定量检测，涵盖实时荧光PCR定性（方法一）、实时荧光PCR定量（方法二）和普通PCR定性（方法三）三种方法。
- 实施日期：2024年12月30日。
2. 核心术语与定义
- 转化体特异性序列：外源插入片段与玉米基因组的连接区序列，用于设计引物和探针。
- 阳性质控品：含0.1%~1.0% BFL4-2的标准物质或验证样品。
- 校准品：用于定量标准曲线的梯度稀释样品，含5个有效浓度。
- ΔCt值：转化体序列与内标基因的Ct值差值；ΔΔCt值：试样与阳性定量质控品的ΔCt差值。
- 检出限（LOD）与定量限（LOQ）：方法一、二LOD为0.05%（20拷贝），方法二LOQ为0.1%（40拷贝）；方法三LOD为0.1%。
3. 检测方法详解
3.1 实时荧光PCR定性检测（方法一）
- 原理：通过引物和探针扩增内标基因（zSSIIb）和转化体特异性序列，依据Ct值判断是否存在目标序列。
- 关键试剂：
- 内标引物/探针（zSSIIb-3F/4R/P，88 bp）。
- BFL4-2特异性引物/探针（BFL4-2-QF/QR/QP，98 bp）。
- 操作步骤：
- DNA提取（按农业部1485号公告）。
- 质控设置（阴性质控：非转基因玉米；空白：水；阳性：含BFL4-2的标准物质）。
- PCR扩增（95℃ 5min→40循环95℃ 15s→60℃ 60s）。
- 结果判定：
- 阳性：内标和BFL4-2均扩增（Ct≤36）。
- ΔΔCt值判断含量高低：≤-0.4为高于/等于阳性定量质控品，>0.4为低于。
3.2 实时荧光PCR定量检测（方法二）
- 原理：通过标准曲线计算转化体与内标基因拷贝数比值，确定含量。
- 校准品制备：梯度稀释BFL4-2基因组DNA，覆盖5个浓度。
- 关键计算：
- 标准曲线公式：Ct = a + b·lg(c)。
- 拷贝数比值公式：cˉk=cˉ2,kcˉ1,k×100%。
- 不确定度评估：基于联合验证数据（u0=0.0025,ur=0.0933）。
- 合格判定：
- 校准品决定系数R²≥0.98，斜率-3.6≤b≤-3.1。
- 阳性定量质控品偏倚需在允许范围内（|bias| < 2×u_bias或sR≤25%）。
3.3 普通PCR定性检测（方法三）
- 原理：通过电泳检测扩增产物（271 bp片段）判断是否含BFL4-2。
- 关键试剂：
- 内标引物（zSSIIb-1F/2R，151 bp）。
- BFL4-2特异性引物（BFL4-2-F/R，271 bp）。
- 操作步骤：
- PCR扩增（94℃ 5min→35循环94℃ 30s→58℃ 30s→72℃ 30s）。
- 电泳检测（2%琼脂糖凝胶，EB染色）。
- 结果判定：阳性需同时扩增内标和BFL4-2片段。
4. 附录内容
- 附录A：提供BFL4-2转化体特异性序列信息：
- 实时荧光PCR靶序列（98 bp）：含引物BFL4-2-QF/QR和探针BFL4-2-QP的结合位点。
- 普通PCR靶序列（271 bp）：含引物BFL4-2-F/R结合位点，覆盖玉米基因组和外源插入片段。
5. 通用要求
- 质控要求：所有方法均需设置阴性、空白和阳性质控，确保实验有效性。
- DNA提取：按农业部1485号公告执行，每个试样取3个平行子样。
- 结果表述：需明确“阳性”“阴性”或“未检出玉米DNA”，定量结果需标注不确定度。
6. 技术参数
- 方法灵敏度：
- 实时荧光法：LOD 0.05%，LOQ 0.1%。
- 普通PCR法：LOD 0.1%。
- 重复性要求：定量方法中试样变异系数（sR）≤25%，阳性质控品偏差≤25%。
7. 应用场景
- 定性检测：快速筛查是否含BFL4-2转化体。
- 定量检测：用于标识阈值判定（如标识阈值为1%时，需测定实际含量）。
- 普通PCR验证：作为补充方法或资源有限时的选择。
总结：该标准系统规范了抗虫耐除草剂玉米BFL4-2的检测流程，涵盖定性和定量技术，强调质控、数据分析和结果可靠性，适用于市场监管、科研及进出口检验等领域。
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