农业农村部公告 第864号-4-2024 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂玉米DBN9858转化体特异性PCR方法 ,该文件为pdf格式 ,请用户放心下载!
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资源简介
中华人民共和国国家标准《转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂玉米DBN9858转化体特异性PCR方法》总结
1. 基本信息
- 标准编号：农业农村部公告第864号一4一2024
- 发布日期：2024年12月30日
- 适用范围：玉米及其制品中DBN9858转化体成分的定性和定量检测。
- 起草单位：中国农业科学院生物技术研究所、农业农村部科技发展中心等。
2. 规范性引用文件
- 包括农业部公告1485号（DNA提取）、1861号（玉米内标基因检测）、2031号（抽样方法），以及NY/T 672（转基因检测通用要求）。
3. 关键术语与定义
- 转化体特异性序列：外源插入片段与玉米基因组的连接区序列。
- ΔCt值：目标序列与内标基因Ct值的差值；ΔΔCt值：试样与阳性对照的ΔCt差值，用于定量分析。
- 检出限（LOD）：定性方法为0.05%，普通PCR为0.1%；定量限（LOQ）为0.1%。
4. 检测方法概述
共提供三种检测方法，可根据需求选择：
- 方法一（实时荧光PCR定性）：通过Ct值判定目标序列存在性，ΔΔCt值辅助判断含量高低。
- 方法二（实时荧光PCR定量）：基于标准曲线计算拷贝数比值，需校准品（5个浓度梯度）和不确定度评估。
- 方法三（普通PCR定性）：通过电泳检测目标条带，辅以测序验证。
5. 通用要求
- 试剂与材料：DNA提取试剂盒、引物/探针（序列见附录A）、缓冲液等。
- 仪器设备：实时荧光PCR仪、电泳系统、离心机、核酸定量仪等。
- 质控设置：
- 阳性质控品：含0.1%-1.0%目标序列的标准物质或验证样品。
- 阴性质控品：非转基因玉米。
- 空白质控：水或空白试剂。
6. 检测流程核心步骤
- 抽样与试样制备：按农业部2031号公告执行，确保代表性。
- DNA提取：采用1485号公告方法，每个试样取3个子样。
- PCR扩增：
- 实时荧光法：使用特异性引物/探针（如zSSIIb内标基因和DBN9858转化体序列），扩增程序为95℃预变性，40循环扩增。
- 普通PCR：扩增后电泳分析，目标片段大小（内标151 bp，转化体239 bp）。
- 结果判定：
- 阳性：目标序列和内标均扩增（Ct≤36或电泳可见条带）。
- 阴性：仅内标扩增，目标无信号。
- 无效检测：内标未扩增，需重新实验。
7. 定量分析（方法二）
- 标准曲线：校准品Ct值与拷贝数对数呈线性（R²≥0.98，斜率-3.6至-3.1）。
- 不确定度评估：通过极差法计算标准不确定度，扩展不确定度（k=2）用于结果表述（如0.5%±0.1%）。
- 合格判定：阳性对照偏差需在允许范围内（相对偏差≤25%）。
8. 附录A（关键序列信息）
- 实时荧光PCR引物/探针：靶向3’端连接区，扩增片段146 bp。
- 普通PCR引物：靶向5’端连接区，扩增片段239 bp。
- 序列验证确保引物特异性，避免非特异性扩增。
9. 注意事项
- 专利声明：文件可能涉及专利，使用需自行确认。
- 方法选择：根据检测需求（定性/定量）、设备条件（是否具备荧光PCR仪）及灵敏度要求选择合适方法。
- 质控重要性：严格设置阴/阳性质控和空白，确保结果可靠性。
10. 应用意义
该标准为耐除草剂玉米DBN9858的转基因成分检测提供了标准化流程，确保检测结果的准确性、可比性和法律效力，适用于市场监管、安全评价及国际贸易中的转基因成分标识管理。
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