农业农村部公告 第864号-3-2024 转基因植物及其产品成分检测 抗虫耐除草剂玉米DBN9936转化体特异性PCR方法

中国国家标准《抗虫耐除草剂玉米DBN9936转化体检测方法》内容总结

• ​​标准号​​：农业农村部公告第864号-3-2024
• ​​名称​​：转基因植物及其产品成分检测 抗虫耐除草剂玉米DBN9936转化体特异性PCR方法
• ​​适用范围​​：适用于玉米及制品中DBN9936转化体成分的定性和定量检测，涵盖实时荧光PCR（定性与定量）及普通PCR定性三种方法。

引用多项农业部公告及标准，包括：

• DNA提取（农业部1485号公告-4-2010）
• 玉米内标基因检测（农业部1861号公告-3-2012）
• 抽样方法（农业部2031号公告19-2013）
• 转基因检测通用要求（NY/T 672）

1. ​​转化体特异性序列​​：外源插入片段与玉米基因组的连接区序列。
2. ​​阳性质控品​​：含0.1%-1.0% DBN9936的标准物质或验证样品，分定性与定量两类。
3. ​​校准品​​：用于定量标准曲线的梯度稀释样品，需含5个有效浓度。
4. ​​ΔCt值​​：转化体序列与内标基因Ct值的差值。
5. ​​ΔΔCt值​​：试样与定量质控品ΔCt值的差值。

1. ​​检测方法选择​​：根据需求选用实时荧光PCR定性、实时荧光PCR定量或普通PCR定性。
2. ​​试剂与模板通用性​​：三种方法的试剂、材料和模板在条件允许时可通用。

• ​​原理​​：通过引物/探针扩增内标基因（zSSIIb）和转化体特异性序列，依据Ct值和扩增曲线判定结果。
• ​​关键试剂​​：
  • 内标基因引物/探针（88 bp）
  • DBN9936特异性引物/探针（76 bp，序列见附录A.1）
• ​​操作流程​​：
  1. 抽样与试样制备（按农业部2031号公告）。
  2. DNA提取（CTAB法或试剂盒）。
  3. 质控设置（阴性、空白、阳性）。
  4. PCR扩增（反应体系25 μL，40循环）。
  5. 结果判定：
  • ​​阳性​​：内标与转化体Ct≤36，ΔΔCt≤-0.4为含量高，反之为低。
  • ​​阴性​​：仅内标扩增或无玉米DNA。
• ​​检出限​​：0.05%（约20拷贝）。

• ​​原理​​：通过校准品标准曲线计算转化体与内标基因拷贝数比值，定量含量。
• ​​校准品制备​​：梯度稀释纯合转化体DNA，涵盖5个浓度。
• ​​关键步骤​​：
  1. 标准曲线绘制（Ct与拷贝数对数的线性关系）。
  2. 不确定度评估（基于联合验证数据）。
• ​​结果计算​​：
  • 定量公式：cˉk​=cˉ2,k​cˉ1,k​​×100
  • 定量限（LOQ）：0.1%（约40拷贝）。
• ​​数据合格标准​​：
  • 阳性定量质控品偏差≤25%，变异系数≤25%。
  • 试样变异系数≤25%（含量≥0.1%时）。

• ​​原理​​：通过特异性引物扩增目标片段（202 bp，序列见附录A.2），电泳判定结果。
• ​​关键试剂​​：
  • 内标基因引物（151 bp）
  • DBN9936特异性引物（202 bp）
• ​​操作流程​​：
  1. PCR扩增（35循环，退火58℃）。
  2. 电泳检测（1%琼脂糖凝胶）。
  3. 测序验证（可选）。
• ​​结果判定​​：
  • ​​阳性​​：内标与转化体条带均出现。
  • ​​阴性​​：仅内标或无玉米DNA。
• ​​检出限​​：0.1%（约40拷贝）。

• ​​A.1​​：实时荧光PCR扩增的76 bp序列（外源插入与基因组连接区）。
• ​​A.2​​：普通PCR扩增的202 bp序列（3'端转化体特异性序列）。

1. ​​质控要求​​：实验需设置阴性质控（非转基因玉米）、空白（水）和阳性质控（标准物质）。
2. ​​数据有效性​​：需满足质控品扩增合格及标准曲线斜率（-3.6~-3.1）、R²≥0.98。
3. ​​不确定度​​：定量结果需标注扩展不确定度（k=2）。

该标准系统规定了DBN9936转化体的检测流程，覆盖从抽样到结果分析的完整链条，确保检测的准确性、可比性和可追溯性。