农业农村部公告 第864号-6-2024 转基因植物及其产品成分检测 抗虫耐除草剂玉米4114转化体特异性PCR方法 ,该文件为pdf格式 ,请用户放心下载!
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资源简介
中国国家标准《转基因植物及其产品成分检测 抗虫耐除草剂玉米4114转化体特异性PCR方法》主要内容总结
1. 范围
- 规定了转基因抗虫耐除草剂玉米4114转化体的实时荧光PCR定性检测、实时荧光PCR定量检测（转化体拷贝数比值）及普通PCR定性检测三种方法。
- 适用于玉米及制品中4114转化体成分的定性和定量分析。
2. 规范性引用文件
- 包括农业部公告1485号（DNA提取）、1861号（玉米内标基因检测）、2031号（抽样方法）及NY/T 672（通用检测要求）。
3. 术语与定义
- 转化体特异性序列：外源插入片段与玉米基因组的连接区序列。
- 阳性质控品：含0.1%~1.0%转基因成分的标准物质或验证样品。
- 校准品：用于定量标准曲线的梯度稀释样品，含5个有效浓度。
- ΔCt值：目标序列与内标基因Ct值的差值。
- ΔΔCt值：试样ΔCt值与阳性定量质控品ΔCt值的差值。
4. 通用要求
- 方法选择：根据检测需求选择定性或定量方法。
- 试剂与模板：三种方法试剂、材料和模板可通用。
方法一：实时荧光PCR定性检测
原理
- 使用特异性引物/探针扩增4114转化体序列，依据Ct值和扩增曲线判断是否存在目标成分，ΔΔCt值判定含量高低。
关键参数
- 引物/探针：
- 内标基因zSSIIb（88 bp）：zSSIIb-3F/4R/zSSIIb-P。
- 4114转化体（102 bp）：4114-qF/qR/qP。
- 检出限（LOD）：0.05%（约20拷贝）。
操作流程
- 抽样与制样：按农业部2031号公告执行。
- DNA提取：使用试剂盒提取，每个试样3个平行。
- 质控设置：非转基因玉米（阴性）、水（空白）、0.1%~1.0%转基因玉米（阳性）。
- PCR扩增：
- 扩增体系25 μL，含DNA模板100 ng。
- 程序：95℃ 5 min；40循环（95℃ 15 s，60℃ 60 s）。
- 结果判定：
- 阳性：内标Ct≤36且4114序列Ct≤36。
- ΔΔCt值≤-0.4为含量高于质控品，>0.4为低于质控品。
方法二：实时荧光PCR定量检测
原理
- 通过标准曲线（Ct值与拷贝数对数的线性关系）计算转化体与内标基因拷贝数比值，确定含量。
关键参数
- 定量限（LOQ）：0.1%（约40拷贝）。
- 标准曲线要求：R²≥0.98，斜率-3.6~-3.1。
操作流程
- 校准品制备：梯度稀释纯合转化体DNA（涵盖5个浓度）。
- 数据计算：
- 计算公式：Ct = a + b·lgc（c为初始模板拷贝数）。
- 拷贝数比值（%） = 转化体拷贝数均值 / 内标拷贝数均值 × 100。
- 不确定度评定：基于联合验证数据（绝对不确定度0.0194，相对0.0339）。
- 结果标示：C = 平均值 ± 扩展不确定度（k=2，95%置信度）。
方法三：普通PCR定性检测
原理
- 通过特异性引物扩增目标序列，电泳检测预期片段（296 bp）。
关键参数
- 引物：
- 内标基因zSSIIb（151 bp）：zSSIIb-1F/2R。
- 4114转化体（296 bp）：4114-F/R。
- 检出限：0.05%。
操作流程
- PCR扩增：35循环（94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s）。
- 电泳分析：琼脂糖凝胶（2%），EB染色，比对DNA分子量标准。
- 测序验证：回收扩增产物测序，比对附录A序列。
附录A（资料性）
- 提供4114转化体特异性序列（实时荧光PCR扩增102 bp，普通PCR扩增296 bp），包括引物结合位点及探针区域。
关键注意事项
- 质控要求：阳性/阴性/空白质控需符合扩增预期。
- 数据有效性：标准曲线、扩增效率、质控品偏差需满足技术指标。
- 结果表述：明确阳性/阴性结论，定量结果需标示不确定度。
此标准为转基因玉米4114的检测提供了全面的技术规范，确保检测结果的准确性、可比性和法律效力。
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