NY/T 4459-2025 水稻品种及其实质性派生品种鉴定 MNP标记法

以下是对《NY/T 4459-2025 水稻品种及其实质性派生品种鉴定MNP标记法》标准的详细总结：

​​一、标准核心信息​​

1. ​​标准属性​​
   • 中华人民共和国农业行业标准（强制性），归口全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277）。
   • ​​实施时间​​：2025年5月1日（发布日期2025年1月9日）。
   • ​​适用范围​​：水稻（Oryza sativa L.）品种鉴定及实质性派生品种（EDV）鉴定。
2. ​​起草单位​​
   江汉大学、农业农村部科技发展中心、武汉明了生物技术有限公司等10家机构，彭海为主要起草人。

​​二、关键术语定义​​

1. ​​多核苷酸多态性（MNP）​​
   一段核苷酸序列中由≥1个核苷酸变异引起的多态性（基于GB/T 38551修改）。
2. ​​实质性派生品种（EDV）​​
   源自原始品种或其派生品种，除派生性状外，基本性状与原始品种相同（引自《种子法》）。
3. ​​关键指标​​
   • ​​平均覆盖倍数​​：标记位点测序片段总数与位点总数的比值。
   • ​​检出标记位点​​：≥20条测序片段支持且能确定等位基因型的位点。

​​三、技术原理​​

利用水稻基因组中稳定的MNP位点，通过以下流程实现鉴定：

1. ​​多重PCR扩增​​：使用特异性引物（附录A）。
2. ​​高通量测序​​：二代测序（读长≥300 bp）。
3. ​​生物信息学分析​​：比对参考基因组，计算遗传相似度（GS）。

​​四、操作程序​​

• ​​样本类型​​：种子、幼苗、叶片、穗子等。
• ​​样本量​​：≥30个个体，可混合检测或单个体检测。
• ​​扦样要求​​：符合GB/T 3543.2标准。

• ​​纯度要求​​：OD260/230 > 2.0，OD260/280 = 1.7–1.9。
• ​​提取试剂​​：未指定品牌，需满足纯度标准。

• ​​试剂盒​​：需匹配MNP标记和测序平台（附录A）。
• ​​循环数​​：≤20次，避免扩增偏差。

• ​​测序仪​​：需匹配试剂盒（如华大智造、真迈生物）。
• ​​参数要求​​：
  • 平均覆盖倍数 ≥700X（初始≥500X）。
  • 总读长 ≥300 bp。

​​五、质量控制​​

• 分区操作：样品准备、DNA提取、PCR、文库构建、测序需在隔离区域进行。
• 设备专用：不同区域仪器不得混用。

​​注​​：附录B提供操作案例，推荐重复检测以降低随机错误。

​​六、数据分析与结果判定​​

• ​​比对与基因型记录​​：测序数据比对至参考基因组，记录等位基因型（示例见附录B.8）。
• ​​遗传相似度（GS）计算​​：
  GS = \frac{n_{ij}}{N_{ij}} \times 100\%
  • n_{ij}：两品种无差异的共有标记数
  • N_{ij}：两品种共有的检出标记总数

​​示例​​：
待测品种A与对照B比较位点数1030，差异位点数10，遗传相似度99.03%，判定为疑同品种。

​​七、附录核心内容​​

1. ​​附录A（规范性）​​
   • ​​MNP标记与引物​​：包含1024个标记的详细信息：
     • 染色体位置
     • 正/反向引物序列（5'→3'）
     • 变异碱基位置及频率（如chr01标记1含9个变异位点）
     • 明恢63 vs 日本晴的等位基因型差异（如标记1：CGTGGCCAC vs CATGGTCAC）
     • 注：部分标记无显著变异（如标记58、101）。
2. ​​附录B（资料性）​​
   • ​​操作案例​​：展示数据比对、基因型记录及判定流程。
   • ​​示例​​：位点基因型记录为"G/A"（表示杂合）或"T"（纯合）。

​​八、技术优势与意义​​

1. ​​高精度​​：MNP标记可检测连续多碱基变异，较SNP更稳定。
2. ​​高通量​​：一次检测1024个标记，覆盖水稻全基因组。
3. ​​标准化​​：统一阈值（96%品种相似性、92% EDV相似性）保障结果可比性。
4. ​​知识产权保护​​：为实质性派生品种提供法定鉴定依据，维护育种者权益。

​​总结​​

该标准建立了基于MNP标记的水稻品种及EDV鉴定全流程体系，涵盖实验操作、数据分析和结果判定，强调质控（如覆盖倍数≥500X、标记检出率≥95%）。通过附录A的1024个标准化标记和明确阈值，推动水稻品种鉴定的精准化与标准化。