农业农村部公告 第864号-11-2024 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂玉米CC-2转化体特异性PCR方法

中华人民共和国国家标准《耐除草剂玉米CC-2转化体检测方法》主要内容总结

• ​​标准编号​​：农业农村部公告第864号-11-2024
• ​​适用范围​​：适用于玉米及其制品中耐除草剂玉米CC-2转化体成分的定性和定量检测。
• ​​核心方法​​：提供三种PCR检测方法：
  1. ​​实时荧光PCR定性检测（方法一）​​
  2. ​​实时荧光PCR定量检测（方法二）​​
  3. ​​普通PCR定性检测（方法三）​​

1. ​​转化体特异性序列​​：外源插入片段与玉米基因组的连接区序列（5'或3'端），含玉米基因组及外源片段部分序列。
2. ​​阳性质控品​​：包括定性质控品（0.1%~1.0%转基因含量）和定量质控品（与标识阈值相当）。
3. ​​校准品​​：用于绘制标准曲线的梯度稀释样品，需含5个有效浓度。
4. ​​ΔCt值​​：转化体特异性序列与内标基因的Ct值差值；​​ΔΔCt值​​：试样ΔCt与阳性定量质控品ΔCt的差值。

• ​​试剂与模板​​：三种方法可共用DNA提取试剂、引物/探针、质控品模板等。
• ​​抽样与试样制备​​：按农业部2031号公告和NY/T 672规定执行，需取3个子样独立检测。

​​1. 原理​​

通过扩增玉米内标基因（zSSIIb）和CC-2转化体特异性序列，根据Ct值和ΔΔCt值判断是否存在目标成分。

​​2. 关键参数​​

• ​​引物/探针​​：
  • 内标基因zSSIIb（88 bp）：引物zSSIIb-3F/4R，探针zSSIIb-P。
  • CC-2特异性序列（107 bp）：引物CC-2-qF/qR，探针CC-2-qP（见附录A.1）。
• ​​扩增条件​​：95℃ 5min预变性；95℃ 15s + 60℃ 60s，40循环。
• ​​质控要求​​：
  • 阳性对照：Ct ≤ 36且典型扩增曲线。
  • 阴性/空白对照：无扩增或Ct > 36。

​​3. 结果判定​​

• ​​阳性​​：内标和CC-2序列均扩增（Ct ≤ 36）。
• ​​阴性​​：仅内标扩增，或内标未扩增（无玉米DNA）。
• ​​含量高低​​：ΔΔCt ≤ -0.4为“≥质控品”；ΔΔCt > 0.4为“<质控品”。
• ​​检出限（LOD）​​：0.05%（20拷贝/反应）。

​​1. 原理​​

通过标准曲线计算转化体拷贝数与内标基因的比值，定量分析转基因含量。

​​2. 关键参数​​

• ​​校准品制备​​：纯合转化体DNA梯度稀释（涵盖5个浓度）。
• ​​标准曲线公式​​：Ct = a + b·lg(c)，要求R² ≥ 0.98，斜率b为-3.1~-3.6。
• ​​定量计算​​：
  • 拷贝数比值 = （转化体拷贝数均值 / 内标基因拷贝数均值）× 100%。
  • 不确定度评定：联合验证数据预评定的标准不确定度（u0=0.0044，ur=0.0384）。

​​3. 结果判定​​

• ​​定量限（LOQ）​​：0.1%（40拷贝/反应）。
• 定量结果表示为“C ± U”（C为均值，U为扩展不确定度）。

​​1. 原理​​

通过普通PCR扩增目标序列，电泳检测产物判断是否存在CC-2转化体。

​​2. 关键参数​​

• ​​引物​​：
  • 内标基因zSSIIb（151 bp）：引物zSSIIb-1F/2R。
  • CC-2特异性序列（132 bp）：引物CC-2-F/R（见附录A.2）。
• ​​扩增条件​​：94℃ 5min预变性；94℃ 30s + 58℃ 30s + 72℃ 30s，35循环；72℃延伸7min。
• ​​电泳检测​​：1%琼脂糖凝胶，溴化乙锭染色（建议用替代染料）。

​​3. 结果判定​​

• ​​阳性​​：内标和132 bp条带均出现。
• ​​阴性​​：仅内标或无条带。
• ​​检出限（LOD）​​：0.1%（40拷贝/反应）。

• ​​A.1实时荧光PCR扩增序列​​：107 bp片段，含玉米基因组（1-40）和外源插入序列（41-107）。
• ​​A.2普通PCR扩增序列​​：132 bp片段，含玉米基因组（1-91）和外源插入序列（92-132）。

• ​​溴化乙锭（EB）​​：具致癌性，操作需戴手套，建议使用替代核酸染料。

​​总结​​：本标准系统规范了耐除草剂玉米CC-2转化体的检测流程，涵盖定性与定量方法，强调质控、校准及结果判定的科学性，适用于市场监管、科研及进出口检验等领域。