农业农村部公告 第864号-10-2024 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂棉花DAS-81910-7转化体特异性PCR方法

中华人民共和国国家标准《转基因植物及其产品成分检测耐除草剂棉花DAS-81910-7转化体特异性PCR方法》主要内容总结

• 规定了耐除草剂棉花DAS-81910-7转化体成分的定性和定量检测方法。
• 适用于棉花及其制品中DAS-81910-7转化体成分的检测，包括：
  • ​​实时荧光PCR定性检测（方法一）​​
  • ​​实时荧光PCR定量检测（方法二）​​
  • ​​普通PCR定性检测（方法三）​​

• 引用多项农业部公告及国家标准，包括DNA提取、内标准基因检测、抽样方法等，确保检测流程的标准化。
• 关键文件：
  • ​​农业部1485号公告-4-2010​​（DNA提取）
  • ​​农业部1943号公告-1-2013​​（棉花内标准基因检测）
  • ​​农业部2031号公告-19-2013​​（抽样方法）

• ​​转化体特异性序列​​：外源插入片段与棉花基因组的连接区序列。
• ​​质控品分类​​：
  • ​​阳性质控品​​（含0.1%~1.0%转化体成分，优先使用有证标准物质）
  • ​​校准品​​（用于定量检测的标准曲线制备，含5个浓度梯度）
  • ​​子样​​（试样预处理后的独立样品）
• ​​ΔCt与ΔΔCt值​​：用于定量分析转化体含量高低的计算指标。

• ​​方法选择​​：根据检测需求选择定性或定量方法，试剂、材料和模板可通用。
• ​​模板制备​​：按农业部1485号公告提取DNA，每个试样取3个平行子样。

• ​​原理​​：通过特异性引物/探针扩增目标序列，依据Ct值及ΔΔCt值判定结果。
• ​​试剂与仪器​​：
  • ​​引物/探针​​：Sad1基因（内标）和DAS-81910-7转化体特异性序列（附录A）。
  • ​​设备​​：实时荧光PCR仪、离心机、核酸定量仪。
• ​​操作流程​​：
  1. ​​质控设置​​：阴性（非转基因棉花）、空白（水）、阳性（含0.1%~1.0%转化体）。
  2. ​​PCR扩增​​：检测内标和转化体序列，Ct值≤36为有效扩增。
  3. ​​结果判定​​：
  • ​​阳性​​：内标和转化体均扩增（Ct≤36）。
  • ​​阴性​​：仅内标扩增或未检出棉花DNA。
  • ​​ΔΔCt值​​：判断含量高低（阈值±0.4）。
• ​​检出限​​：0.05%（约10拷贝）。

• ​​原理​​：通过校准品标准曲线计算转化体拷贝数与内标比值，确定含量。
• ​​校准品制备​​：梯度稀释转化体DNA（涵盖5个浓度，定量限0.1%）。
• ​​数据计算​​：
  • ​​标准曲线​​：Ct值与初始模板拷贝数对数的线性关系（R²≥0.98）。
  • ​​不确定度评估​​：联合验证数据预评定的绝对和相对标准不确定度。
• ​​结果判定​​：
  • ​​定量结果​​：以平均值±扩展不确定度（k=2）表示。
  • ​​检出限​​：0.05%，​​定量限​​：0.1%（约20拷贝）。

• ​​原理​​：通过普通PCR扩增目标片段，电泳检测条带。
• ​​试剂与仪器​​：
  • ​​引物​​：ACP基因（内标）和DAS-81910-7特异性引物（附录A）。
  • ​​设备​​：PCR仪、电泳装置、凝胶成像系统。
• ​​操作流程​​：
  • ​​电泳检测​​：210 bp（内标）和140 bp（转化体）条带。
  • ​​测序验证​​：回收扩增产物测序比对。
• ​​检出限​​：0.1%（约20拷贝）。

• ​​质控要求​​：
  • 阳性/阴性/空白质控品需在每次实验中同步检测。
  • 数据有效性判定：标准曲线斜率（-3.6~-3.1）、变异系数（≤25%）。
• ​​验证措施​​：
  • 扩增产物测序确认特异性。
  • 多家实验室联合验证不确定度参数。

• 提供转化体特异性序列及引物/探针设计信息：
  • ​​实时荧光PCR​​：120 bp扩增片段（引物QF/QR，探针QP）。
  • ​​普通PCR​​：140 bp扩增片段（引物F/R）。

​​核心目的​​：通过标准化PCR方法，确保耐除草剂棉花DAS-81910-7转化体成分的准确检测，为转基因生物安全管理提供技术依据。