前 言
为贯彻《中华 外来入侵
物种管 入侵水
生动物调
本 外来入
侵水生动物
本
本 J 为规
范性附录本
本本本本
1 适用范围
3 术语和定义
3.1
3.2
外来水生动物 alien aquatic animals
在我国无天然分布，经直接或间接人为途径传入的水生动物，包括该动物所有可能存活和繁殖的部分、配子或繁殖体。
3.3
外来入侵水生动物 invasive alien aquatic animals
传入定殖并对生态系统 生境 物种带来威胁或者危害 影响我国生态环境 损害农林牧渔业可持续发展
3.4
环境
环境 DNA
的集合 的细胞
或游离
3.5
阳性对照
确 否可靠。
3.6
阴性对照
确 是否被
污染。
3.7
最低检测限
一
3.8
实时荧光 reaction(qPCR)
在 物结合
而释放 模板量进
行定量分
3.9
定量循环
q
3.10
技术重复
对 随机误
差，提高
3.11
引物
在 定长度
和顺序的
4 试剂、
包括
5 目标物种
目标物种依据农业农村部、生态环境部等公开发布的外来入侵物种管理名单确定，并根据最新公开
发布或修编的外来入侵物种名录同步更新，参见附录 B。
6 评估程序
基于环境 体外来入侵水生 布评估 入侵水
生动物采 动物分布 程序见
图 1 基于环境 DNA 的内陆水体外来入侵水生动物调查与分布评估程序
7 资料收集
8.2 采样
表 1 湖库区采样点参考数量
8.2.1.3 水田采样点布设
以田埂为边界将大片水田划分为单块水田 每块水田按五点采样法或随机法布设 ～ 个采样点，采样点
8.2.2
根 物样本。目标物种 可采
集沉积
8.2.3
采样 时间需
满足以
a
b
c
d
e f
8.2.4
8.2.4.1
a
b 该点水
8.2.4.2
8.2.4.3 积推荐
为1 L， 悬浮颗粒物后再
8.2.4.4 积生物残体，
8.3 保存
8.3.1 过滤间
隔不宜
8.3.2 温保存。
保存及
8.3.3 当需要常温保存或运输时，可将滤膜或沉积物样本迅速浸没到附录E推荐的固定剂中，固定剂类
型参见附录E 。保存和运输过程避免阳光直射。
9 外来入侵水生动物分布评估
9.1 环境
9.1.1
水体样
a b
9.1.2
9.1.2.1 多糖、 RNA等
9.1.2.2 L，最
佳质量 280 nm)
应在1.7 符合浓
度和纯 的qPCR检测，
9.2 qPCR
9.2.1
9.2.1.1 50℃~
68℃范围内 构。引
物对中 宜比引物的退火温
9.2.1.2 反应。 9.2.2
每个 确其对
应的 Cq 。
9.2.3
按照
a 液。标
信水平下
Cq 值。
9.3 采样点评估
9.3.1 样本评估结果
按照以下要求明确样本评估结果:
a ) 2 份及以上技术重复检测的 cq值均≤LOD对应的cq值 , 认定该样本为阳性样本, 检出 目标物种成分;
b ) 仅 1 份技术重复检测的 ca值≤op 对应的ca值, 应重新检测该样本。重新检测样本设置 3
个技术重复 , 当 1 份及以上技术重复检测的 cq值≤LOD 对应的 cq值 , 认定该样本为阳性样本, 检出 目标物种成分; 否则 , 认定该样本为阴性样本, 未检出 目标物种成分;
c ) 不符合上述, 认定该样 阴 未检出 成分
9.3.2 采样点评估结果
按照以下要求明确环境DNA采样点评估结果 :
a)同一采样点存在 2 个及以上阳性样本, 该采样点为阳性采样点 ; b , 不符合上述情况, 该采样点为阴性采样点 。
9.4 区域分布评估
9.4.1 确定评估主体
按照以下要求确定评估主体 , 明确区域内阳性采样点数量: a 宜以评段为进行分 ;
b ) 湖泊和水库宜开展整体评估, 河道型或狭长型湖库宜参照河流进行分布评估;
c 田 。
9.4.2 评估主体阳性采样点所占比重测算
评估主体阳性采样点所占比重按照公式 (1) 计算 :
P=(M/NMX100% (1)
式中：P 阳性采样点所占比重 , %;
M 阳性采样点数量;
9.4.3 评估主体分布评估等级划分
评估主体外来入侵水生动物分布评估等级依据P值划分 , 具体如下 :
a ) P值为 0 , 无 ;
b ) P值在 0 - 10%, 零星分布;
c ) P值在 10% (含) 30%, 局部 ;
d ) P值为30% (含) 以上, 广泛分布
10 质量控制与质量保证
10.1 质量控制
10.1.1 环境DNA样本采集过程中以无菌水为阴性对照 , 用于检测采集过程中的污染 。
10.1.2 qpcR检测过程中以等体积己知浓度目标物种DNA为阳性对照 , 同步进行qpcR扩增 。阳性对照样本q pcR检测cq值LOD对应的cq值则可判断整个反应体系和反应过程可靠 。
10.1.3 qpcR检测过程中以无菌水为阴性对照 , 用于排除检测过程中污染造成的假阳性。阴性对照样本qPCR检测>LOD对应的cq值则可判断该过程中受试样本未被污染 .
10.1.4 每个采样点平行采集3个样本, 每个样本qpcR扩增过程设置3个技术重复 , 必要时可增加样本数和技术
10.2 质量保证
10.2.1 环境DNA样本采集前应彻底灭活设备和装置 , 按照附录 I 的规定做好样本采集、采样记录、样
本运输, 防止样本交叉污染。
10.2.2 实验过程应防止样本污染, 按照附录 J 的规定做好环境DNA提取、 cq值确定、 数据记录、样本保存和数据保存。
11 废弃物处理
参照 NT4835 规定执行废弃物的分类 、隔离 、收集、贮存、处理和处置 。生物废弃物在处理之前应采用高压灭菌 、消毒或灼烧等方式灭活。实验过程中产生的废物应集中收集 , 分类保存 , 及时处理，并做好处理记录 。
12 评估告编制
基于环境 DNA 的内陆水体外来入侵水生动物调查与分布评估报告内容包括前言 、评估区域概况、目标物种概述、 采样方法和流程、 分布评估结果、对策与建议等, 评估报告编写格式参见附录 K 。
附 录 A
(资料性附录)
A.1 试剂
A.1.1
除
A.1.2
A.1.2.1
A.1.2.2
A.1.3
推荐使需试剂
A.1.3.1
A.1.3.2
A.1.3.3
A.1.3.4
A.1.3.5适量无A.1.3.6
A.1.3.7
A.1.3.8
A.1.3.9
A.1.3.10溶于适量pH 约
A.1.3.11
A.1.3.12
A.1.3.13 (A.1.3.1 A.1.3.14
A.1.3.15
A.1.3.16
A.1.3.17 阳性对照样品：已知物种组成的基因组 DNA 或人工合成含有目标序列的 DNA 片段的混合物，市售。
A.1.4 PCR 检测试剂
A.1.4.1 特异性引物：外来入侵水生动物环境 扩增引物 可选择 对或多对
A.1.4.2 和 PCR
缓冲液
A.1.4.3 至 1 L， pH=7.8
A.1.4.4
A.1.4.5 包含若干
条单一
A.1.4.6
A.1.4.7
A.2 仪器设
A.2.1
A.2.1.1
A.2.1.2
A.2.1.3
A.2.1.4
A.2.1.5
A.2.1.6 A.2.1.7
A.2.1.8 A.2.2
A.2.2.1
A.2.2.2
A.2.2.3
A.2.2.4
A.2.2.5
A.2.2.6 A.2.2.7
A.2.2.8
A.2.2.9
A.2.2.10
A.2.2.11
A.2.2.12 A.2.2.13 凝胶成像仪：具备 DNA 凝胶成像拍照功能。
附 录 B
(资料性附录)主要外来
附 录 C (资料性附录)
附 录 D
D.1
D.2
(资料性附录)
图 D.2 湖库外来入侵水生动物环境 DNA 采样点布设示意图
附 录 E
(资料性附录)
E.1 乙醇固定剂
附 录 F
(规范性附录)
F.1 序列比
参照
将引物和
选出特异性产物的序
针检测
F.2 实
以
进行 q
与目标序
附 录 G
(资料性附录)
qPCR
实验单DNA 样DNA 样DNA 样
注：琼
附 录 H
(资料性附录)
图 H.1 LOD 在标准曲线中位置示例
注：LOD 的确定应在 qPCR 实验条件优化后进行，包括退火温度、引物/探针浓度等，这些因素都会影响 qPCR 效率;每个标准浓度有足够的重复数才能确保 LOD 数值准确;当将实验转移到新的实验体系时，应重新确定 LOD。
附 录 I
(规范性附录)
附 录 J
(规范性附录)
J.1 实
J.1.1
J.1.2
J.1.3
J.2 基本
J.2.1
J.2.2 枪)应
进行定
J.2.3 。
J.2.4
J.2.5
J.2.6
J.2.7
J.2.8
J.2.9
J.2.10
J.2.11
J.3 环境
J.3.1
J.3.2
J.3.3
J.3.4
J.3.5
J.3.6
J.3.7 冰箱，
若条件
J.4 Cq
J.4.1 标准曲线应具有 R2值接近 1(通常>0.99)。
J.4.2 在分析 Cq 值时，应排除极端值与异常波动值。
J.4.3 Cq 值确定过程中的数据应妥善存储，并按照要求记录保存位置。
J.5 数据记录
详 所有数
据记录的 则数
据应定
J.6 样
J.6.1 。
J.6.2 储存室。
J.6.3
J.7 数
数据
附 录 K
(资料性附录)
K.1 摘
概述
K.2 目
一
K.3 正文
K.3.1
包括
K.3.2
包括
K.3.3
包括
K.3.4
包括
K.3.5
包括
K.3.6
针
K.4 参考
列
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