中华人民共和国医药行业标准
YY/T 1953—2026
纳米医疗器械生物学评价 抗菌性能试验
Biologicalevaluation ofnanomaterialmedicaldevices—
Testforantimicrobialperformance
2026-03-09发布 2027-03-01实施
前 言
本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。
本文件由国家药品监督管理局提出 。
本文件由全国医疗 器 械 生 物 学 评 价 标 准 化 技 术 委 员 会 纳 米 医 疗 器 械 生 物 学 评 价 分 技 术 委 员 会(SAC/TC248/SC 1)归 口 。
本文件起草单位 : 中国食品药品检定研究院 、山东省医疗器械和药品包装检验研究院 、广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 、中关村汇智抗菌新材料产业技术创新联盟 、安信纳米生物科技(珠海)有限公司 、施乐辉医用产品国际贸易(上海)有限公司 、中纺标(浙江)检测有限公司 、张家港耐尔纳米科技有限公司 。
本文件主要起草人 :段晓杰、栾同青、彭如群、张迎增、方良艳、谢小保、周家发、盘俐、斯沿洲、阮关强、张峰 。
引
言
随着我国纳米技术产业突飞猛进的发展 ,一些纳米材料被应用于医疗器械产品的研发及应用 ,如含纳米材料敷料 、纳米材料涂层导管等 。纳米材料具有的小尺寸效应和高比表面活性使其易于透过细菌细胞膜 ,直接作用于细胞 ,甚至细胞内核酸 ,从而发挥抗菌抑菌作用 。例如 ,纳米银具有广谱抗菌性 ,其可能的作用机制为 : 破 坏 和 穿 透 细 菌 细 胞 膜 , 改 变 其 结 构 和 通 透 性 ; 进 入 细 胞 内 部 , 通 过 改 变 细 胞 的DNA结构以及干扰蛋白质合成等方式 ,杀灭微生物 。 除此之外 ,纳米银可能释放银离子 ,其电荷作用也可以影响细胞成分相互作用 ,改变代谢途径 ,甚至遗传物质 ,从而发挥抗菌作用 。不同的纳米材料发挥抗菌作用的机理可能不一样 ,其抗菌效果也不尽相同 , 因此 ,抗菌性能是该类医疗器械安全性及有效性评价的主要内容之一 ,也是其进入临床研究及注册上市的准入门槛 。
针对无机纳米材料的抗菌性能评价可参考 GB/T 21510。 然而 , 当前缺少评价应用纳米材料医疗器械抗菌性能的标准化方法 。现行常规的抗菌性能评价方法没有针对纳米材料特点 ,存在一定的不适用性 ,无法有效地评价该类产品的抗菌性能 。例如 ,使用常规抑菌环法检测纳米银敷料时 , 由于纳米银附着方式不同 ,一些产品的抑菌圈不明显 ,不能对其抗菌能力进行客观的评价 。
本文件针对应用纳米材料医疗器械的抗菌作用特点 ,建立了适合评价其抗菌性能的标准化试验方法 ,为合理开展该类产品的抗菌性能检测评价提供技术支持 。
纳米医疗器械生物学评价 抗菌性能试验
1 范围
本文件描述了应用 纳 米 材 料 医 疗 器 械 的 抗 菌 性 能 试 验 方 法 , 包 括 琼 脂 平 皿 扩 散 法 、吸 收 法 和 振荡法 。
本文件适用于应用纳米材料医疗器械的抗菌性能评价 。
注 1: 目前主要包括与体表创面接触的含纳米材料医疗器械 。
注 2: 目前本文件主要提供抑菌性能试验方法 ,杀菌性能试验方法待技术成熟后 ,考虑纳入本文件 。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 , 注 日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。
YY/T 1477. 1 接触性创面敷料性能评价用标准试验模型 第 1部分 评价抗菌活性的体外创面模型
中华人民共和国药典(2020年版)
消毒技术规范(2002年版)
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件 。
3. 1
纳米材料 nanomaterial
任一外部维度 、内部或表面结构处于 1 nm~ 100 nm 尺寸范围的材料 。
[来源 :GB/T 30544. 4—2019,2. 3,有修改]
3.2
抗菌 antimicrobial
采用化学或物理方法杀灭细菌和真菌或抑制其生长繁殖及其活性的过程 。
[来源 :《消毒技术规范》(2002年版) ,1. 3. 30,有修改]
3.3
菌落形成单位 colony forming unit,CFU
在活菌培养计数时 , 由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落 。注 : 以其表达活菌的数量 。
3.4
受试样品 testsample
从应用纳米材料医疗器械产品制备的样品 ,含有相应比例的纳米材料组分 。
3.5
对照样品 controlsample
除不含纳米材料组分外 ,其余与受试样品(3. 4)一致 。
4 主要设备、试验材料、试剂及其配制
4. 1 主要设备
主要设备包括 :
a) Ⅱ级生物安全柜 ;
b) 恒温培养箱 ;
c) 真菌培养箱 ;
d) 恒温水浴箱 ;
e) 压力蒸汽灭菌器 ;
f) 显微镜 。
4.2 试验材料
试验材料包括 :
a) ϕ90 mm 灭菌玻璃平皿或无菌聚苯乙烯平皿 ;
b) 移液管 、离心管等实验室常用器具 ;
c) 带盖烧瓶 、灭菌容器瓶 。
4.3 试验菌株
试验菌株包括 :
a) 革兰氏阳性菌 :金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus,ATCC6538、CMCC(B)26003] ;
b) 革兰氏阴性菌 :铜绿假单胞菌[Pseudomonas aeruginosa,ATCC15442、CMCC(B)10104]或肺炎克雷伯氏菌[Klebsiella pneumoniae, ATCC 4352、CMCC(B)46117]或 大 肠 埃 希 菌[Esche- richia coli,ATCC 8099、CMCC(B)44102] ;
c) 真菌 : 白色念珠菌[Candida albicans,ATCC 10231、CMCC(F)98001] 。
注 : 根据实际使用场景 ,采用其他的试验菌株及相应的培养基和培养条件 。
4.4 主要试剂及其配制
试剂应为分析纯的或适用于微生物试验 。试验用水应为用于制备微生物用培养基的分析级的纯化 ,可通过蒸馏 、离子交换或者反渗装置过滤等方法制取 ,应无毒和无抗菌物质 。
主要试剂配制方法如下 。
a) 胰蛋白胨大豆肉汤培养基(Tryptone Soy Broth,TSB)
胰蛋白胨 15g、大豆蛋白胨 5 g、氯化钠 5 g,用水最终定容至 1000mL,灭菌后 ,pH为 7.2±0.2。
b) 胰蛋白胨大豆琼脂培养基(Tryptone Soybean Agar,TSA)
胰蛋白胨 15 g、大豆蛋白胨 5 g、氯化钠 5 g、琼脂 15 g,用水最终定容至 1000 mL,灭菌后 ,pH为 7. 2±0. 2。
c) 营养肉汤培养基(NutrientBroth,NB)
蛋白胨 5 g、牛肉膏 3 g,用水最终定容至 1 000 mL,灭菌后 ,pH 为 7. 2±0. 2。
d) 沙氏葡萄糖琼脂培养基(Sabouraud Dextrose Agar,SDA)
动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物 15 g、葡萄糖 40 g、琼脂 20 g,用水最终定容至1 000 mL,灭菌后 ,pH 为 5. 6±0. 2。
e) 沙氏葡萄糖液体培养基(Sabouraud Dextrose Broth,SDB)
动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物 10g、葡萄糖 20 g,用水最终定容至 1000 mL,灭
菌后 ,pH为 5. 6±0.2。
f) SCDLP液体培养基(Soya Casein DigestLecithin Polysorbate Broth)
酪蛋白胨 17 g、大豆蛋白胨 3 g、葡萄糖 2. 5 g、氯化钠 5 g、磷酸氢二钾 2. 5 g、卵磷脂 1 g、吐温807 g,用水最终定容至 1 000 mL,灭菌后 ,pH 为 7. 2±0. 2。
g) 0. 03 mol/L,pH 7. 2 的磷酸盐缓冲液 (Phosphate Buffered Saline,PBS)
无水磷酸氢二钠 2.83g、磷酸二氢钾 1.36g,用水最终定容至 1000mL,灭菌后 ,pH为 7.2±0.2。注 1: 建议使用现有商业化的脱水原料制备培养基 ,并严格按照相关产品制造商的使用说明操作 。
注 2: 根据受试样品的特性 ,选用经验证的适宜溶液作为中和剂或洗脱液 。
5 抗菌性能评价试验方法
5. 1 琼脂平皿扩散法
5. 1. 1 试验原理和适用性
受试样品与带有试验菌的琼脂培养基接触一定时间后 ,培养基与受试样品接触部位及其边界处会出现无试验菌生长的区域(即抑菌带) ,通过测定抑菌带的大小评价受试样品的抗菌能力 。本方法适用于含纳米材料敷料等产品的抗菌性能的定性评价 。
5. 1.2 样品制备
不同类型的受试样品制备方法如下 。
a) 敷料类产品 :选取含有纳米材料涂层部位(或直接与人体接触部位)为受试样品 ,每种试验菌用受试样品制成直径为 25 mm±5 mm 的片状 ,每组 4 片 (块) 。
注 1: 敷料类产品 ,将圆片裁切成小条 ,排放在培养基上 ,每条之间留有小缝隙 , 以防止由于敷料产品 编 织 紧 密 影 响需氧菌生长 。
注 2: 敷料类产品试验前一天 ,无 菌 操 作 , 取 受 试 样 品 和 对 照 样 品 , 分 别 置 于 无 菌 容 器 中 , 在 恒 温 箱[温 度 20 ℃ ± 2 ℃ ,相对湿度 70%]中放置 18h~ 24h。
b) 导管类产品可按其成品工艺定制受试样品 ,制成直径为 25 mm±5 mm 的片状 ,每组 4片 (块) 。
5. 1.3 试验菌液的制备
接种试验菌株的新鲜培养物至适宜液体培养液中 ,适宜温度下培养一定的时间后 , 上述培养物用PBS稀释制备成菌液浓度为 1×108 CFU/mL~ 5×108 CFU/mL 的菌悬液 。
注 : 一般细菌在 30 ℃ ~ 35 ℃下培养 16h~ 18h 后 ,酵母菌在 20 ℃ ~ 25 ℃下培养 24h~ 48h。
5. 1.4 试验步骤
5. 1.4. 1 下层培养基制备 :将冷却至 40 ℃ ~45 ℃的熔化琼脂培养基倾注于无菌平皿(φ90 mm) 中 ,琼脂厚度为 4 mm ,冷却至凝结 。
5. 1.4.2 上层培养基制备 :准备 40 ℃ ~45 ℃的熔化琼脂培养基 ,加入试验菌液 ,振荡混匀至菌液浓度为 5×105 CFU/mL~ 5×106 CFU/mL, 向 5. 1. 4. 1 中的平皿(倾注上层前预热)快速倾注 5 mL上层培养基 ,使其均匀分散铺在下层培养基表面 ,凝固后 1 h 内使用 。
5. 1.4.3 供试品加样 :分别取受试样品(含纳米材料涂层部位)和对照样品放于平皿 ,各样片中心之间相距 25 mm 以上 ,与平皿的周缘相距 15 mm 以上 。贴放好后 ,用无菌镊子轻压样片 ,使受试样品(含纳米材料 涂 层 部 位)和 对 照 样 品 紧 贴 于 平 板 表 面 。 盖 好 平 皿 。 每 个 平 皿 贴 放 4 片 受 试 样 品 , 1 片 对 照 样品 ,共 5 片 。
5. 1.4.4 培养 :将上述琼脂培养基平皿置于培养箱中培养 。细菌在 30 ℃ ~ 35 ℃下培养不少于 18 h,酵
母菌在 20 ℃ ~ 25 ℃下培养不少于 48h,受试样品和对照样品应同时结束培养 。
5. 1.5 数据采集和分析结果判定
5. 1.5. 1 试验有效性判定条件
试验有效性判定条件为 :
a) 对照样品应无抑菌带产生 ,否则试验无效 ;
b) 接种用的试验菌液浓度应符合(5. 1. 4. 2)要求 ,否则试验无效 。
5. 1.5.2 结果计算和观察
应选均匀且完全无菌生长的抑菌带 , 以其外沿为直径进行测量 。 每个试样于不同部位随机测量至少 3 次 ,按式(1)计算试样的抑菌带宽度 。
H = (D-d)/2 … … … … … … … … … … ( 1 )
测量抑菌带后 ,用镊子将琼脂上的样品轻轻移去 , 肉眼或显微镜下观察并描述琼脂上样品下面区域的试验菌生长情况 。
5. 1.5.3 结果评价
根据试验菌生长情况和抑菌带宽度 ,按表 1评价受试样品的抗菌能力 。
表 1 抗菌性能描述
5.2 吸收法
5.2. 1 试验原理和适用性
将一定量的试验菌液接种至吸水性受试样品 ,接触一定时间后 ,采用洗脱试验样品回收试验菌液的方法 ,测定洗脱液中的菌数并计算抑菌值 ,评价受试样品的抗菌性能 。本方法适用于含纳米材料敷料等产品的抗菌性能的定量评价 。
5.2.2 样品制备
无菌操作 ,取受试样品 ,将受试样品剪切或定制成表面积为 3. 8 cm×3. 8 cm 的材料 ,称取 1. 0 g±
0. 1 g 为 1份样品 。
对照样品按上述方法制备 。取 6个受试样品和 6 个对照样品 ,分别置于带盖的无菌容器内 。敷料类产品试验前一天置于无菌容器中 ,在恒温箱(温度 20 ℃ ±2 ℃ ,相对湿度 70 %)中放置 18h~ 24h。
5.2.3 试验菌液的制备
接种试验菌株的新鲜培养物至肉汤培养液中 ,适宜温度下培养适宜的时间 ,上述培养物用 PBS稀释制备成菌液浓度为 1×105 CFU/mL~ 5×105 CFU/mL 的菌悬液 。
5.2.4 试验步骤
5.2.4. 1 接种试验菌液
取试验菌液(5. 2. 3)0. 2 mL,尽量均匀(见图 1)接种在每个制备的样品上(5. 2. 2) ,注意不要将菌液粘附在试验容器壁上 ,盖紧容器盖 。
图 1 布点参考图
5.2.4.2 0 时组— 接种后洗脱
接种试验菌液后马上洗脱 。按 5. 2. 2制备对照样品和受试样品各 3 个 ,每个样品加入 SCDLP培养基 (或中和剂或洗脱液)20 mL,手振摇(30 s、摆幅 30 cm)或者漩涡振荡器(5 次 、5 s/次)或均质器振摇(无菌均质袋每面拍打 1 min)后 ,将洗脱液转移至无菌容器瓶中 。 吸取 1. 0 mL,用 PBS作适宜稀释 ,按照附录 A计算菌数 。
5.2.4.3 试验组— 培养后洗脱
取 3个对照样品和 3个受试样品(5. 2. 2) ,置于培养箱中 ,37℃ ±2℃下培养 18h~ 24h。取培养后的样品 ,每个 样 品 加 入 SCDLP 培 养 基(或 中 和 剂 或 洗 脱 液)振 摇 洗 脱 液 20 mL, 手 振 摇 (30 s、摆 幅30 cm)或者漩涡振荡器(5次 、5 s/次)或均质器振摇(无菌均质袋每面拍打 1 min)后 ,将洗脱液转移至无菌容器瓶中 。 吸取 1. 0 mL,需要时用 PBS作适宜稀释 ,按照附录 A计算菌数 。
5.2.5 数据采集和分析结果判定
5.2.5. 1 结果计算
按式(2)计算试样的菌数 。
M = Cb × 20 … … … … … … … … … … ( 2 )
5.2.5.2 判定条件
满足以下所有要求时 ,试验判定为有效 ;否则试验无效 ,重新进行试验 。
a) 接种用菌液浓度(5. 2. 3)应为 1×105 CFU/mL~ 5×105 CFU/mL。
b) 0 时组 3个对照样品菌数对数值极差应<1;试验组 3个对照样品菌数对数值极差应<1。
c) 0 时组 3个受试样品菌数对数值极差应<2;试验组 3个受试样品菌数对数值极差应<2。
d) 试验组的对照样品菌数与 0 时组对照样品菌数的对数值减差应 ≥1,按式(3)计算 。
F= lgCt-lgC0 … … … … … … … … … … ( 3 )
5.2.5.3 抑菌值的计算
按式(4)计算抑菌值 。
式中 :
A — 抑菌值 ;
G — 受试样品的菌数增长值 ;
Tt — 试验组 3个受试样品培养 18h~ 24h后的菌液浓度平均值 ;
T0 —0 时组 3个受试样品的菌液浓度平均值 。
5.3 振荡法
5.3. 1 试验原理和适用性
将应用纳米材料医疗器械在液体条件下通过振荡培养 ,与试验菌充分接触一定时间后 ,通过测定振荡前后的菌液浓度的差值 ,评价受试样品的抗菌性能 。本方法适用于采用含纳米材料固体产品的抗菌性能的定量评价 。
注 : 接触性创面敷料的性能评价参考 YY/T 1477. 1。
5.3.2 样品制备
无菌操作下取受试样品 ,将受试样品剪切或定制成表面积为 10 cm×10 cm 的材料 ,称取 0. 75 g± 0. 05 g 为 1份样品 。对照样品也按上述方法制备 。
5.3.3 试验菌液的制备
接种试验菌株的新鲜培养物至肉汤培养液中 ,适宜温度培养适宜的时间 ,上述培养物用 PBS溶液稀释成菌液浓度为 1×105 CFU/mL~ 9×105 CFU/mL 的菌悬液 。
5.3.4 试验步骤
5.3.4. 1 样品分组
准备 9个 250 mL 的灭菌三角烧瓶(或带盖无菌容器) 。在其中 3个瓶中分别加入对照样品(5. 3. 2)各 1份 ,3个瓶中分别放入受试样品(5. 3. 2)各 1份 ,另 3个瓶不加样品作为空白对照 。分别向每瓶加入70 mLPBS。
5.3.4.2 0 时组样品制备和培养
用移液管向 3个对照样品瓶和 3个空白样品(5. 3. 4. 1)瓶中分别加入 5 mL 试验菌液(5. 3. 3) ,使菌液浓度为 1× 104 CFU/mL~ 9× 104 CFU/mL。 盖 好 瓶 盖 。 将 上 述 制 备 好 的 样 品 瓶 置 于 恒 温 摇 床 , 20 ℃ ~25 ℃下 ,300 r/min振摇 1 min±10 s。吸取 1.0 mL样液 ,需要时用 PBS作适宜稀释 ,按照附录 A计算菌数 。
5.3.4.3 振荡试验组样品制备和培养
用移液管向另外 3个受试样品瓶中分别加入 5 mL 试验菌液(5. 3. 3) ,盖好瓶盖 。 连同制备的 6 瓶0 时组样品瓶(5. 3. 4. 2) , 置 于 恒 温 摇 床 , 20 ℃ ~ 25 ℃下 , (150±50) r/min振 摇 1 h。 吸 取 1. 0 mL 样液 ,需要时用 PBS作适宜稀释 ,按照附录 A计算菌数 。
注 : 更长时间培养的方法参考 YY/T 1477. 1。
5.3.5 数据采集和分析结果判定
5.3.5. 1 结果计算
按式(5)计算每个样品的菌数 。
M =Cb ×d … … … … … … … … … … ( 5 )
5.3.5.2 判定条件
当满足以下所有要求时 ,试验判定为有效 ;否则试验无效 ,重新进行试验 。
a) 3个空白样品菌液浓度(5. 3. 4. 2)应为 1×104 CFU/mL~ 9× 104 CFU/mL,且振荡前后平均菌数差值绝对值在 10%以内 。
b) 振摇培养 0 h后的对照样品的平均菌数与振摇培养 1 h后的对照样品的平均菌数差应不大于68% ,按式(6)计算 。
Y … … … … … … … … … … ( 6 )
式中 :
Y — 试验样品组的抑菌率 ;
Pt— 试验组 3个试验样品振摇培养 1 h后的菌数平均值 ;
P0—0 时组 3个试验样品的菌数平均值 。
5.3.5.3 抑菌率差值的计算
振摇培养 1 h后 ,按式(7)计算抑菌率差值 。
式中 :
A — 抑菌率差值 ;
YS — 受试样品组的抑菌率 ;
YNC — 对照样品组的抑菌率 。
6 试验报告
试验报告中应包含以下信息 :
a) 受试样品 :来源 、批号 、型号/规格 、性状 、保存条件 ;
b) 对照样品 :来源 、型号/规格 ;
c) 试验方法 ;
d) 试验菌株 :
1) 所用菌株名称 、试验时浓度 ;
2) 试验菌株培养条件及方法 ;
e) 试验条件 :
培养基种类及培养条件 ;
f) 结果 ;
g) 结论 。
附 录 A (规范性)平皿计数法
A. 1 概述
平皿计数法是通过培养后计算菌落形成数量的方法 。平皿计数法包括倾注法和涂布法 。每株试验菌每种培养基至少制备 2个平皿 , 以算术平均值作为计数结果 。
a) 倾注法 :
取按照 5. 2. 4 和 5. 3. 4 制 备 的 样 液(或 适 宜 稀 释 级) 1 mL, 置 于 无 菌 平 皿 中 , 注 入 15 mL~ 20mL温度不超过 45 ℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基 ,混匀 ,凝固 ,倒置培养 。计算各试验组的平均菌数 。
b) 涂布法 :
取 15mL~ 20mL温度不超过 45℃的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基 ,注入无菌平皿 ,凝固 ,制成平板 ,采用适宜的 方 法 使 培 养 基 表 面 干 燥 。 取 按 照 5. 2. 4 和 5. 3. 4 制 备 的 样 液(或适宜稀释级) ,每一平板表面接种不少于 0. 1 mL。按规定条件培养 、计数 。计算各试验组的平均菌数 。
A.2 培养、计数及菌数报告规则
A.2. 1 培养和计数
除另有规定外 ,胰酪大豆胨琼脂培养基平板在 30 ℃ ~ 35 ℃下培养 2 d~ 3 d,沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在 20 ℃ ~ 25 ℃下培养 3 d~ 5 d,观察菌落生长情况 ,点计平板上生长的所有菌数 ,计数并报告 。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数 。点计菌数后 ,计算各稀释级供试液的平均菌数 ,按菌数报告规则报告菌数 。若同稀释级两个平板的菌数平均值不小于 15,则两个平板的菌数不能相差 1倍或 1倍以上 。
A.2.2 菌数报告规则
需氧菌总数测定宜选取平均菌数小于 300 CFU 的稀释级 、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌数小于 100CFU 的稀释级 ,作为菌数报告的依据 。
评论