GB 5009.86-2025 食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定

　　中华人民共和国国家标准

GB5009.86—2025

食品安全国家标准

食品中抗坏血酸的测定

2025-09-02发布2026-03-02实施

中华人民共和国国家卫生健康委员会

国家市场监督管理总局发布

前 言

本标准代替GB5413.18—2010《婴幼儿食品和乳品中维生素C的测定》和GB5009.86—2016《食品

中抗坏血酸的测定》。

本标准与GB5009.86—2016相比,主要变化如下:

———扩大了液相色谱法和荧光分光光度法的适用范围;

———修改了液相色谱法和荧光分光光度法检出限、定量限和标准曲线浓度范围;

———优化了液相色谱法的色谱条件。

Ⅰ

GB5009.86—2025

食品安全国家标准

食品中抗坏血酸的测定

1 范围

本标准规定了食品中抗坏血酸的测定方法。

第一法液相色谱法适用于食品中L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸的测定。

第二法荧光分光光度法适用于特殊膳食用食品、乳及乳制品、水果和蔬菜及其制品中抗坏血酸的测

定,以及未添加D-异抗坏血酸的上述食品中L-抗坏血酸的测定。

第三法2,6-二氯靛酚滴定法适用于水果和蔬菜及其制品中还原型抗坏血酸的测定。

第一法 液相色谱法

2 原理

试样中的抗坏血酸经提取、还原和稀释后,以含有离子对试剂和还原剂的混合溶液作为流动相,经

反相色谱分离,紫外检测器或二极管阵列检测器检测,以色谱峰的保留时间定性,外标法定量。

3 试剂和材料

除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。

3.1 试剂

3.1.1 冰乙酸(C2H4O2)。

3.1.2 三氯乙酸(C2HCl3O2,TCA)。

3.1.3 偏磷酸(HPO3)。

3.1.4 40%四丁基氢氧化铵水溶液(40%TBAH)。

3.1.5 乙酸铵(C2H7NO2)。

3.1.6 L-半胱氨酸(C3H7NO2S)。

3.1.7 三(2-羧乙基)膦(C9H15O6P,TCEP)。

3.1.8 乙腈(C2H3N):色谱纯。

3.2 试剂配制

3.2.1 乙酸铵溶液(500mmol/L,pH5.4):称取乙酸铵19.27g,加水溶解并稀释至500mL,用冰乙酸

调pH 至5.4。

3.2.2 TCA 溶液(150g/L):称取TCA75g,加水溶解并稀释至500mL,混匀。

3.2.3 偏磷酸溶液(200g/L):称取偏磷酸100g,加水溶解并稀释至500mL,混匀。

3.2.4 TCEP溶液(250mg/L):称取TCEP125mg,加水溶解并稀释至500mL,混匀。

3.2.5 L-半胱氨酸溶液(40g/L):称取L-半胱氨酸40g,加适量水超声溶解,再加水稀释至1L,混匀。

1

GB5009.86—2025

临用现配。

3.2.6 流动相:量取水900mL于烧杯中,吸取40%TBAH 溶液3.25mL、称取乙酸铵3.85g置于水

中,然后加入TCEP50 mg(或L-半胱氨酸溶液20 mL),再加入乙腈10 mL,混匀后用冰乙酸(约

3.14mL)调pH 至4.5~5.0;最后加水稀释至1L,混匀;超声除去气泡。

3.3 标准品

3.3.1 L-抗坏血酸标准品(C6H8O6,CAS号:50-81-7):纯度≥99%,或经国家认证并授予标准物质证

书的标准品。

3.3.2 D-异抗坏血酸标准品(C6H8O6,CAS号:89-65-6):纯度≥99%,或经国家认证并授予标准物质

证书的标准品。

3.4 标准溶液配制

3.4.1 L-抗坏血酸标准溶液(50μg/mL):称取L-抗坏血酸标准品10mg(精确至0.1mg),用TCEP溶

液溶解并定容至10mL,混匀。准确吸取上述标准溶液500μL于10mL棕色容量瓶中,用TCEP溶液

定容,混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器中,临用现配。

3.4.2 D-异抗坏血酸标准溶液(50μg/mL):称取D-异抗坏血酸标准品10 mg(精确至0.1 mg),用

TCEP溶液溶解并定容至10mL,混匀。准确吸取上述标准溶液500μL于10mL棕色容量瓶中,用

TCEP溶液定容,混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器中,临用现配。

3.4.3 L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸标准系列工作液:分别准确吸取L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸标准

溶液(50μg/mL)10μL、100μL、200μL、400μL、1000μL和2000μL于10mL棕色容量瓶中,用流动

相定容,轻摇混匀。L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸标准系列工作液的质量浓度分别为0.05μg/mL、

0.50μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL和10μg/mL,临用现配。

注:可依据实际待测样品情况,在线性范围内适当调整标准溶液浓度范围。

4 仪器和设备

4.1 液相色谱仪:配有紫外检测器或二极管阵列检测器。

4.2 天平:感量分别为0.01mg和0.1mg。

4.3 pH 计:精度为0.1。

4.4 涡旋混合器:转速不低于1500r/min。

4.5 离心机:转速不低于5000r/min。

4.6 超声波清洗仪。

5 分析步骤

5.1 试样制备

液体样品和浆体样品摇匀;半固态样品和粉状样品混匀;胶基糖果等胶状样品需剪刀剪碎或冷冻状

态粉碎混匀;其他样品需匀浆或粉碎混匀。水果和蔬菜及其制品(取可食部分)需10∶1加入150g/L

的TCA 溶液或200g/L的偏磷酸溶液匀浆或粉碎均匀。

注:处理过程应尽可能在避光条件下进行;所有样品制备后立即进行下一步试验。

2

GB5009.86—2025

5.1.1 试样称取

5.1.1.1 固体(含半固体)样品

称取制备后的试样25g(精确至0.001g)于锥形瓶中,加入TCEP溶液225g(精确至0.001g),充

分溶解混匀。称取混匀后的溶液2g(精确至0.001g)于10mL容量瓶中。

5.1.1.2 液体(含浆体)样品

称取制备后的试样2g(精确至0.001g)或准确吸取2mL于10mL容量瓶中。

5.1.2 试样提取与还原

于上述10mL容量瓶中,加入TCEP溶液(或L-半胱氨酸溶液)4mL,再加入TCA 溶液2mL混

匀,静置反应5min,用水定容,混匀。然后转移至离心管,5000r/min离心1min,此样液为还原样液。

注:氨基酸配方粉、蛋白水解配方粉、部分蛋白水解配方粉等特殊医学用途配方食品和羊乳粉应使用L-半胱氨酸作

为还原剂。

5.1.3 试样稀释

吸取离心后的上清液1mL于10mL容量瓶中,加乙酸铵溶液1mL,用流动相定容,混匀,此样液

为稀释样液。取适量过0.22μm 水系微孔滤膜至棕色进样瓶中,供液相色谱测定。

注:必要时,可改变稀释倍数,确保待测液中抗坏血酸浓度在线性范围内。

5.2 仪器参考条件

5.2.1 色谱柱:C18柱(柱长150mm,内径4.6mm,填料粒径4μm)或性能相当的色谱柱。

5.2.2 柱温:室温。

5.2.3 流动相:按照3.2.6配制。

5.2.4 流速:1.0mL/min。

5.2.5 检测波长:265nm。

5.2.6 进样量:10μL。

5.3 标准曲线的制作

将标准系列工作液分别注入液相色谱仪中,得到相应的峰面积,以标准系列工作液中L-抗坏血酸

或D-异抗坏血酸的浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸标

准溶液的色谱图参见附录A 中图A.1。

5.4 试样溶液的测定

将试样溶液注入液相色谱仪中,得到抗坏血酸的峰面积,根据标准曲线得到待测液中抗坏血酸的

浓度。

6 分析结果的表述

试样中L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸的含量按公式(1)计算:

X =ρ×M0 ×V1 ×V3 ×f ×100 m0 ×m ×V2 ×1000 …………………………(1)

3

GB5009.86—2025

式中:

X ———试样中L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸的含量,单位为毫克每百克(mg/100g)或毫克每百

毫升(mg/100mL);

ρ ———由标准曲线得到的试样溶液中L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸的质量浓度,单位为微克每

毫升(μg/mL);

M0 ———固体(含半固体)样品加TCEP溶液溶解后的总质量,单位为克(g);

V1 ———还原样液的总体积,单位为毫升(mL);

V3 ———稀释样液的总体积,单位为毫升(mL);

f ———试样稀释因子;

100 ———换算系数;

m0 ———固体(含半固体)样品的称样量,单位为克(g);

m ———液体(含浆体)样品或制备的样液的取样量,单位为克(g)或毫升(mL);

V2 ———还原样液的取样体积,单位为毫升(mL);

1000———换算系数。

计算结果保留3位有效数字。

注1:水果和蔬菜及其制品试样的稀释因子需按样品与保护剂质量比计算。

注2:L-抗坏血酸与D-异抗坏血酸之和为抗坏血酸含量。

注3:抗坏血酸盐的含量可根据相对分子质量换算。

7 精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

8 其他

固体(含半固体)样品,取样量25g时,L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸的检出限均为1.00mg/100g,定量限

均为3.00mg/100g。

液体(含浆体)样品,取样量2g(或2 mL)时,L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸的检出限均为

0.100mg/100g(或0.100mg/100mL),定量限均为0.300mg/100g(或0.300mg/100mL)。

第二法 荧光分光光度法

9 原理

试样中抗坏血酸在活性炭催化作用下,被氧化为脱氢抗坏血酸后与邻苯二胺(OPDA)反应生成有

荧光的喹唔啉,其荧光强度与抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比,以此测定试样中抗坏血酸的含量。

10 试剂和材料

除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。

10.1 试剂

10.1.1 淀粉酶:酶活力1.5U/mg。

4

GB5009.86—2025

10.1.2 三水合乙酸钠(C2H3O2Na·3H2O)。

10.1.3 偏磷酸(HPO3)。

10.1.4 乙酸溶液(36%)。

10.1.5 盐酸溶液(12mol/L)。

10.1.6 硼酸(H3BO3)。

10.1.7 邻苯二胺(C6H8N2)。

10.1.8 亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6]。

10.1.9 活性炭/酸性活性炭(C)。

10.2 试剂配制

10.2.1 偏磷酸-乙酸溶液A:称取偏磷酸15g并量取36%乙酸溶液40mL于200mL水中,溶解并稀

释至500mL。

10.2.2 偏磷酸-乙酸溶液B:称取偏磷酸15g并量取36%乙酸溶液40mL于100mL水中,溶解并稀

释至250mL。

10.2.3 乙酸钠溶液:称取三水合乙酸钠500g,用水溶解并稀释至1L。

10.2.4 硼酸-乙酸钠溶液:称取硼酸3g,用乙酸钠溶液溶解并稀释至100mL,临用现配。

10.2.5 邻苯二胺溶液(400mg/L):称取邻苯二胺40mg,用水溶解并稀释至100mL,临用现配。

10.2.6 盐酸溶液(10%):量取12mol/L的盐酸溶液274mL,用水溶解并稀释至1L。

10.2.7 盐酸溶液(1%):吸取12mol/L的盐酸溶液2.74mL,用水溶解并稀释至100mL。

10.2.8 亚铁氰化钾溶液(20g/L):称取亚铁氰化钾2g,用水溶解并稀释至100mL。

10.2.9 酸性活性炭:称取活性炭约200g于大烧杯中,加入10%的盐酸溶液1L,加热至沸腾,减压过

滤,取下结块置于另一个大烧杯中,用玻璃棒打散活性炭结块,用水清洗(清洗过程中应不断搅拌)至滤

液中无铁离子为止,在105℃烘箱中干燥约10h后使用。

注:采用商品化酸性活性炭,可减免酸洗过程,需检验铁离子进行验收,检验方法见附录B。

10.3 标准品

L-抗坏血酸标准品(C6H8O6,CAS号:50-81-7):纯度≥99%,或经国家认证并授予标准物质证书的

标准品。

10.4 标准溶液配制(200μg/mL)

称取L-抗坏血酸标准品20mg(精确至0.1mg),用偏磷酸-乙酸溶液A 溶解并定容至100mL,临

用现配。

11 仪器和设备

11.1 荧光分光光度计。

11.2 天平:感量为0.01mg、0.1mg和0.1g。

11.3 烘箱:精度1℃。

11.4 恒温培养箱:精度1℃。

12 分析步骤

处理过程应尽可能在避光条件下进行。

5

GB5009.86—2025

12.1 试样制备

液体样品和浆体样品摇匀;半固态样品和粉状样品混匀;其他样品需匀浆或粉碎均匀;水果和蔬菜

及其制品(取可食部分)需1∶1加入偏磷酸-乙酸溶液匀浆或粉碎均匀。

12.1.1 特殊膳食用食品和乳及乳制品

12.1.1.1 含淀粉试样

称取制备后的固体(含半固体)试样5g(精确至0.001g)或称取制备后的液体(含浆体)试样10g

(精确至0.001g)于碘量瓶中,加入淀粉酶0.1g,固体(含半固体)试样加入45 ℃ ~50 ℃ 的温水

50mL,液体(含浆体)试样加入45℃~50℃的温水40mL,混合均匀后,充氮气排除瓶中空气,盖上瓶

塞,置于45℃ ± 1 ℃恒温培养箱内30min,取出冷却至室温,用偏磷酸-乙酸溶液B 转移并定容至

100mL。

注:淀粉酶根据活力单位大小调整用量。

12.1.1.2 不含淀粉试样

称取制备后的固体(含半固体)试样5g(精确至0.001g),用偏磷酸-乙酸溶液A 溶解并定容至

100mL。或称取制备后的液体(含浆体)试样10g(精确至0.001g),用偏磷酸-乙酸溶液A 溶解并定容

至100mL。

12.1.2 水果和蔬菜及其制品

称取匀浆或粉碎后含保护剂的试样20g(精确至0.001g)(相当于10g样品),用偏磷酸-乙酸溶液

A 稀释并定容至100mL。

注:必要时,可改变稀释倍数,确保待测液中抗坏血酸浓度在线性范围内。

12.2 反应液的制备

12.2.1 氧化液制备

将上述标准溶液(200μg/mL)和试样溶液分别转移至锥形瓶中,加入酸性活性炭2g,剧烈振摇

1min,过滤至滤液澄清(弃去约5mL初滤液)。即为标准氧化液和试样氧化液。

12.2.2 空白液制备

分别准确吸取标准氧化液和试样氧化液5mL 于50mL 具塞比色管中,加入硼酸-乙酸钠溶液

5mL,室温静置30min,用水定容;然后再分别准确吸取定容后的溶液2mL 于10mL 具塞比色管

中,加入邻苯二胺溶液5mL,混匀,室温避光放置60min。即为标准空白液和试样空白液。

12.2.3 标准工作液制备

准确吸取标准氧化液5mL于50mL具塞比色管中,加入乙酸钠溶液5mL,室温静置30min,用水

定容;分别准确吸取定容后的溶液0.05 mL、0.50 mL、1.25 mL、2.50 mL、5.00 mL 和10.00 mL 于

10mL容量瓶中,用水定容。然后分别准确吸取2mL溶液至10mL具塞比色管中,加入邻苯二胺溶液

5mL,混匀,室温避光放置60 min。即为标准工作液,质量浓度分别为1.00μg/mL、10.0μg/mL、

25.0μg/mL、50.0μg/mL、100μg/mL和200μg/mL。

注:可依据实际待检测样品情况,在线性范围内适当调整标准溶液浓度范围;样品溶液与标准品溶液同步操作

后,不再考虑反应液引起的样品溶液稀释倍数变化和标准溶液浓度的变化。

6

GB5009.86—2025

12.2.4 试样待测液制备

准确吸取试样氧化液5mL于50mL具塞比色管中,加入乙酸钠溶液5mL,室温静置30min,用水

定容;然后准确吸取定容后的溶液2mL于10mL具塞比色管中,加入邻苯二胺溶液5mL,混匀,室温

避光放置60min。即为试样待测液。

12.3 测定

12.3.1 标准曲线的制作

将标准空白液和标准工作液依次转入比色皿中,于激发波长350nm、发射波长430nm 条件下分别

测定其荧光响应值。以标准工作液荧光响应值分别减去标准空白液荧光响应值为纵坐标,对应的抗坏

血酸浓度为横坐标,绘制标准曲线。

12.3.2 试样溶液的测定

将试样空白液和试样待测液依次转入比色皿中,于激发波长350nm、发射波长430nm 条件下分别

测定其荧光响应值。试样待测液荧光响应值减去试样空白液荧光响应值后在标准曲线上查得对应抗坏

血酸的浓度。

注1:比色皿放入比色室后,应在3s内完成荧光值测定,避免荧光淬灭对测定结果的影响。

注2:脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应,以此排除试样中荧光杂质产生的干扰,此方法不适用

于试样空白液响应值远高于待测物响应值的样品。

13 分析结果的表述

试样中抗坏血酸的含量按公式(2)计算:

X =c×V ×f ×100 m ×1000 …………………………(2)

X ———试样中抗坏血酸的含量,单位为毫克每百克(mg/100g);

c ———由标准曲线查得的试样测定液中抗坏血酸的质量浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);

V ———试样的定容体积,单位为毫升(mL);

f ———试样稀释因子;

100 ———换算系数;

m ———试样的质量,单位为克(g);

1000———换算系数。

计算结果保留3位有效数字。

注:水果和蔬菜及其制品试样的稀释因子需按样品与保护剂质量比计算。

14 精密度

在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

15 其他

固体(含半固体)样品,取样量5g时,检出限为3.00mg/100g,定量限为10.0mg/100g。

7

GB5009.86—2025

液体(含浆体)样品,取样量10g时,检出限为1.50mg/100g,定量限为5.00mg/100g。

第三法 2,6-二氯靛酚滴定法

16 原理

用蓝色的碱性染料2,6-二氯靛酚标准溶液对含还原型抗坏血酸的试样酸性浸出液进行氧化还原

滴定,2,6-二氯靛酚被还原为无色,当到达滴定终点时,多余的2,6-二氯靛酚在酸性介质中显浅红色,由

2,6-二氯靛酚的消耗量计算样品中还原型抗坏血酸的含量。

17 试剂和材料

除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。

17.1 试剂

17.1.1 偏磷酸(HPO3):≥38%。

17.1.2 草酸(C2H2O4)。

17.1.3 碳酸氢钠(NaHCO3)。

17.1.4 2,6-二氯靛酚(2,6-二氯靛酚钠盐,C12H6Cl2NNaO2)。

17.1.5 白陶土(或高岭土):对抗坏血酸无吸附性。

17.2 试剂配制

17.2.1 偏磷酸溶液(20g/L):称取偏磷酸20g,用水溶解并定容至1L。

17.2.2 草酸溶液(20g/L):称取草酸20g,用水溶解并定容至1L。

17.2.3 2,6-二氯靛酚(2,6-二氯靛酚钠盐)溶液。

称取碳酸氢钠52mg溶解在200mL热蒸馏水中,然后称取2,6-二氯靛酚50mg溶解在上述碳酸

氢钠溶液中。冷却并用水定容至250mL,过滤至棕色瓶内,于4 ℃环境中保存。每次使用前,用L-抗

坏血酸标准溶液标定其滴定度。

标定方法:准确吸取L-抗坏血酸标准溶液1mL于50mL锥形瓶中,加入偏磷酸溶液或草酸溶液

10mL,摇匀,用2,6-二氯靛酚溶液滴定至粉红色,保持15s不褪色为止。同时另取偏磷酸溶液或草酸

溶液10mL做空白试验。2,6-二氯靛酚溶液的滴定度按公式(3)计算:

T = c×V

V1 -V0 …………………………(3)

式中:

T ———2,6-二氯靛酚溶液的滴定度,即每毫升2,6-二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克数,单位

为毫克每毫升(mg/mL);

c ———L-抗坏血酸标准溶液的质量浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL);

V ———吸取L-抗坏血酸标准溶液的体积,单位为毫升(mL);

V1 ———滴定L-抗坏血酸标准溶液所消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积,单位为毫升(mL);

V0 ———滴定空白所消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积,单位为毫升(mL)。

17.3 标准品

L-抗坏血酸标准品(C6H8O6,CAS号:50-81-7):纯度≥99%,或经国家认证并授予标准物质证书的

8

GB5009.86—2025

标准品。

17.4 标准溶液配制

L-抗坏血酸标准溶液(1.0mg/mL):称取L-抗坏血酸标准品100mg(精确至0.1mg),溶于偏磷酸

溶液或草酸溶液并定容至100mL,临用现配。

18 分析步骤

整个检测过程应在避光条件下进行。

18.1 试液制备

称取具有代表性样品的可食部分100g,放入粉碎机中,加入偏磷酸溶液或草酸溶液100g,迅速捣

成匀浆。准确称取匀浆样品10g~40g(精确至0.01g)于烧杯中,用偏磷酸溶液或草酸溶液将样品转

移至100mL容量瓶,并稀释至刻度,摇匀后过滤。若滤液有颜色,可按每克样品加0.4g白陶土脱色后

再过滤。

18.2 滴定

准确吸取滤液10mL于50mL锥形瓶中,用标定过的2,6-二氯靛酚溶液滴定,直至溶液呈粉红色

15s不褪色为止。同时做空白试验。

注:此方法不适用于脱色后本底颜色干扰滴定终点观察的样品。

19 结果计算

试样中还原型抗坏血酸的含量按公式(4)计算:

X = (V -V0)×T ×A

m ×100 …………………………(4)

式中:

X ———试样中还原型抗坏血酸的含量,单位为毫克每百克(mg/100g);

V ———滴定试样所消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积,单位为毫升(mL);

V0 ———滴定空白所消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积,单位为毫升(mL);

T ———2,6-二氯靛酚溶液的滴定度,即每毫升2,6-二氯靛酚溶液相当于还原型抗坏血酸的毫克数

(mg/mL);

A ———稀释倍数;

m ———试样质量,单位为克(g)。

计算结果保留3位有效数字。

20 精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值,含量>20mg/100g时,不得超过算术平均

值的2%;含量≤20mg/100g时,不得超过算术平均值的5%。

9

GB5009.86—2025

附 录 A

L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸标准溶液色谱图

L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸标准溶液色谱图见图A.1。

图A.1 L-抗坏血酸(1.0μg/mL)、D-异抗坏血酸(1.0μg/mL)标准溶液色谱图

10

GB5009.86—2025

附 录 B

铁离子检验方法

普鲁士蓝反应:将20g/L亚铁氰化钾溶液与体积分数为1%的盐酸溶液等量混合,将活性炭洗出

滤液滴入,如有铁离子则产生蓝色沉淀。

11

GB5009.86—2025