NY/T 4500-2025 萝卜品种鉴定 SSR分子标记法

《萝卜品种鉴定SSR分子标记法》标准主要内容总结

一、标准概述

《萝卜品种鉴定SSR分子标记法》(NY/T 4500-2025)是由中华人民共和国农业农村部发布的农业行业标准，规定了利用简单重复序列(SSR)标记进行萝卜(Raphanus sativus L.)品种鉴定的技术规范。该标准由农业农村部种业管理司提出，全国植物新品种测试标准化技术委员会归口，山东省农业科学院作物研究所等单位起草。

二、适用范围

本文件适用于萝卜品种DNA分子数据采集和品种鉴定，可用于区分不同萝卜品种。标准适用于种子、幼苗、叶片等组织或器官的样品检测。

三、技术原理

该标准基于萝卜品种基因组中存在的SSR标记多态性进行品种鉴定。不同萝卜品种在同一SSR位点的重复次数存在差异，这种差异可通过PCR扩增及电泳方法进行检测，从而区分不同品种。

四、主要技术内容

1. 样品准备

• 送检样品可为种子、幼苗、叶片等组织或器官
• 种子样品扦样应符合GB/T 3543.2要求
• 每份样品不少于30个个体，等量混合分析

2. DNA提取

• 采用CTAB法提取DNA
• 详细描述了从组织研磨到DNA溶解保存的完整流程
• 要求DNA溶液的OD260/OD280比值介于1.7～2.0

3. PCR扩增

• 提供了标准反应体系(25μL总体积)和反应程序
• 采用降落PCR程序：15个循环(退火温度从65℃开始，每循环降1℃)加30个循环(50℃退火)
• 允许根据实验条件调整参数

4. PCR产物检测方法

标准提供了两种电泳检测方法：

(1) 垂直板变性PAGE

• 详细描述了制胶、变性、电泳和银染步骤
• 使用6%聚丙烯酰胺凝胶
• 1800V恒压电泳，时间根据产物大小调整(1.5-3.5小时)

(2) 荧光毛细管电泳

• 根据引物分组(附录F)混合不同荧光标记的扩增产物
• 使用DNA分析仪进行电泳
• 需加入分子量内标和去离子甲酰胺变性

5. 数据分析

• 通过比较扩增片段大小确定等位变异
• 纯合位点记录为X/X，杂合位点记录为X/Y
• 缺失位点记录为0/0
• 比对送检样品与对照样品的等位变异数据，统计差异位点数

6. 结果判定

• 差异位点数>2：判定为"不同"
• 差异位点数≤2：判定为"疑同"

五、配套附录内容

1. 规范性附录

• ​附录A​：详细列出了所需的主要仪器设备和试剂
• ​附录B​：提供了各种溶液的配制方法，包括DNA提取液、PCR试剂、电泳相关溶液等
• ​附录C​：包含20对SSR引物的名称、染色体位置和序列信息

2. 资料性附录

• ​附录D​：提供了每对引物的荧光标记建议、等位变异范围和主要等位变异大小
• ​附录E​：列出了28个参照品种的名称和来源
• ​附录F​：给出了荧光毛细管电泳时的引物分组方案

六、标准特点

1. ​技术全面性​：涵盖了从样品准备到结果判定的完整流程
2. ​方法可选性​：提供PAGE和荧光毛细管电泳两种检测方法
3. ​操作规范性​：详细规定了各种试剂配制和实验步骤
4. ​数据可比性​：通过参照品种确保不同实验室间数据的可比性
5. ​判定科学性​：设定了明确的判定阈值(2个差异位点)
6. ​实用性​：允许根据实际情况调整部分参数

该标准的实施将为萝卜品种鉴定提供统一的技术规范，有助于品种权保护、种子质量监管和品种真实性鉴定等工作。