SC/T 7246-2025 蛙脑膜炎诊断方法

水产行业标准SC/T 7246-2025《蛙脑膜炎诊断方法》主要内容总结如下：

一、适用范围

适用于米尔伊丽莎白菌（Elizabethkingia miricola）引起的牛蛙、黑斑蛙、棘胸蛙等蛙类脑膜炎的流行病学调查、诊断、检疫和监测。

二、规范性引用文件

包括GB/T 6682（实验室用水标准）、SC/T 7011.1/7011.2（水生动物疾病术语与命名）、SC/T 7202.3-2007（组织病理学诊断法）等。

三、术语定义

• ​蛙脑膜炎​：由米尔伊丽莎白菌感染引发的疾病，典型症状包括平衡失调、歪头、眼膜发白、眼球晶状体不透明等（附图C.1示例）。

四、试剂与材料

1. ​化学试剂​：乙醚、氯仿、石蜡、琼脂糖、SYBR Green qPCR预混液等。
2. ​缓冲液与配制​（附录A）：
   • 抽提缓冲液（含Tris-HCl、EDTA、SDS等）
   • 10 mol/L乙酸铵、TE缓冲液、电泳缓冲液等。
3. ​引物序列​：
   • ​套式PCR​：第一轮引物EMi-576F1/R1（扩增576 bp片段），第二轮EMi-308F2/R2（扩增308 bp片段）。
   • ​qPCR引物​：EMi-q137F/R（扩增137 bp片段）。
4. ​对照设置​：阳性对照（米尔伊丽莎白菌DNA）、阴性对照（健康蛙组织）、空白对照（水）。

五、仪器设备

包括切片机、PCR仪、荧光定量PCR仪、高速离心机、电泳仪、显微镜等实验室设备。

六、临床症状

病蛙表现为：

• 反应迟钝、离群独游
• ​典型症状​：头部歪斜、身体失衡打转、眼膜发白、眼球晶状体浑浊（图C.1）。

七、样品采集与处理

1. ​对象​：优先选择有症状的蝌蚪或蛙，无症状样本需采集≥150尾/只，有症状≥30尾/只。
2. ​组织选择​：取脑、眼膜、心脏组织，无菌操作。
3. ​保存运输​：冷藏运送，避免DNA降解。

八、检测方法

1. ​组织病理学检测​

• ​步骤​：麻醉活蛙→取脑/眼组织→4%多聚甲醛固定→石蜡包埋切片→苏木精-伊红染色→显微镜观察。
• ​阳性判定​：脑膜炎（脑膜炎症，图C.2）或眼内炎/角膜上皮增生（图C.3）。

2. ​套式PCR检测​

• ​DNA提取​：酚-氯仿法或商品化试剂盒。
• ​扩增程序​：
  • 第一轮PCR（30循环）：95℃ 5min→94℃ 30s→66℃ 30s→72℃ 40s。
  • 第二轮PCR（30循环）：95℃ 5min→94℃ 30s→66℃ 30s→72℃ 30s。
• ​结果判定​：
  • 第一轮产物576 bp，第二轮308 bp。
  • 测序比对（与GenBank CP040516一致性≥96%）确认阳性。

3. ​染料法qPCR检测​

• ​反应体系​：SYBR Green预混液，引物终浓度0.2 μmol/L。
• ​扩增程序​：95℃ 10min→40循环（95℃ 10s→62℃ 30s）。
• ​判定标准​：
  • Ct≤35且熔解曲线单峰（81.0±0.8℃）为阳性；
  • 35<Ct<40需复测确认。

九、综合判定

1. ​疑似病例​：符合以下任一条件：
   • 典型临床症状；
   • 组织病理阳性；
   • PCR或qPCR阳性。
2. ​确诊病例​：PCR/qPCR阳性且符合临床症状或组织病理阳性。
3. ​阴性病例​：无典型症状、组织病理阴性且PCR/qPCR阴性。

十、附录

• ​附录A​：试剂配方（抽提缓冲液、蛋白酶K、电泳缓冲液等）。
• ​附录B​：引物靶基因位置（GenBank CP040516）。
• ​附录C​：临床症状与病理特征图示（图C.1-C.3）。

关键质量控制

• ​对照设置​：每批次实验需包含阳性、阴性及空白对照。
• ​重复检测​：qPCR临界值样本需复测确认。
• ​测序验证​：PCR阳性样本需测序比对确保特异性。

该标准为蛙脑膜炎的诊断提供了系统化的技术流程，涵盖从临床症状观察到分子检测的综合方法，适用于水产养殖病害防控与检疫。