T/CVMA 202-2024 副猪格拉菌抗体微量凝集试验操作规程

ICS 11.220
CCS B 41
团体标准
T/CVMA 202—2024
副猪格拉菌抗体微量凝集试验操作规程
Procedures for the operation of microagglutination test for antibody against Haemophilus parasuis
2024 - 12 - 4发布2024 - 12 - 4实施
中国兽医协会发布

前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由青岛市动物疫病预防控制中心提出。
本文件由中国兽医协会归口。
本文件主要起草单位：青岛市动物疫病预防控制中心、青岛农业大学、青岛博霖生物科技有限公司、青岛市黄岛区动物疫病预防与控制中心。
本文件主要起草人：李彦、赵永达、郭莉莉、段笑笑、杨胜男、邴啟政、马帅、尹斐斐、田丽华、高斌、厉博雅、王守杰、柳妍玲、陈佳文。

T/CVMA 202—2024
1
副猪格拉菌抗体微量凝集试验操作规程
1 范围
本文件规定了副猪格拉菌微量凝集抗体检测的操作规程。
本文件适用于副猪格拉菌的抗体水平检测、疫病诊断及监测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室生物安全通用要求
GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫
NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CFU：菌落形成单位（Colony-Forming Units）
HPS：副猪格拉菌（Haemophilus parasuis）
MAT：微量凝集抗体检测试验（micro-agglutination test）
PBS：磷酸缓冲盐溶液（phosphate belanced solution）
SPF：无特定病原体动物（Specific Pathogen Free）
5 试剂与材料
5.1 阳性血清：由副猪格拉菌血清4型、5型和13型标准菌株制备的疫苗免疫SPF兔后制备的高免血清。
5.2 阴性血清：采集SPF兔血液制备的血清。
5.3 菌株：副猪格拉菌血清4型、5型和13型标准菌株，冻干型。
T/CVMA 202—2024
2
6 仪器设备
6.1 紫外分光光度计：190 ~ 1100 nm。
6.2 恒温恒湿培养箱：0 ℃ ~ 65 ℃、±1.0 ℃； 不均匀度≤±1 ℃。
6.3 分析天平：精度为0.001 g。
6.4 离心机：转速不低于13,000 r/min。
6.5 冰箱：2 ℃ ~ 8℃和-20 ℃以下。
6.6 酸度计。
6.7 电热恒温水槽：室温至100 ℃，温度精度±0.5 ℃。
6.8 涡旋振荡器。
6.9 微量移液器（量程：0.5 μL ~ 10 μL、2 μL ~ 20 μL、20 μL ~ 200 μL和200 μL ~ 1 000 μL）。
6.10 无菌离心管（规格：1.5mL、10 mL、50 mL）。
7 实验步骤
7.1 通则
应符合GB 19489和NY/T 541中关于实验室生物安全和兽医诊断样品的采集、保存与运输的要求。
7.2 血液样品采集与处理
静脉无菌采血。采集后的血液室温静置不少于2 h，待自然凝固后，4000 r/min离心10 min，吸出上层血清待检。
7.3 样品保存和运输
样品采集后应冷链运输，并于24 h内送达实验室。在2 ℃ ~ 8 ℃条件下保存不应超过24 h，如超过24 h需冷冻保存。如无法冷链运输，应将样品置于含10%甘油的平衡盐溶液（配制方法按照附录A中A.1）中运输。
7.4 抗原制备
7.4.1 菌株复苏取副猪格拉菌血清4型、5型和13型标准冻干菌株，加入2.0 mL灭菌生理盐水溶解，分别划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂TSA培养基（含5%无菌牛血清和0.01%NAD）（配制方法按照附录A中A.2），于恒温培养箱中5 % CO2、37 ℃培养48 h。
7.4.2 菌液扩繁分别挑取多个典型菌落密集划线接种于TSA培养基，置于5 % CO2、37 ℃恒温培养箱中培养12 h ~ 16 h后，用灭菌生理盐水分别洗下菌苔，用紫外分光光度计测定OD600，并进行活菌计数，用灭菌生理盐水适量稀释，使各菌株的活菌量约为3.0 ×l09 CFU/mL。
T/CVMA 202—2024
3
7.4.3 菌液灭活按体积比向菌液中加入终浓度为0.2 %甲醛溶液，37 ℃灭活16 h，用灭菌生理盐水洗涤3次后，用灭菌生理盐水恢复原体积，按照《中国兽药典》要求进行无菌检验后，作为检测用抗原。
7.5 稀释液制备
0.15 mol/L，pH值为7.2的PBS（配制方法按照附录A中A.3）。
7.6 阴性血清和阳性血清制备
7.6.1 阴性血清制备
采集分离未免疫的SPF兔血清，作为阴性血清，置于-70℃保存。
7.6.2 阳性血清制备
7.6.2.1
菌株的培养
将副猪格拉菌血清4型、5型和13型标准菌株复苏后，分别在高压灭菌的胰蛋白胨大豆琼脂TSA培养基（含5 %无菌牛血清和0.01 %NAD）上均匀涂布作扩大培养，37 ℃培养16 h后，用PBS（配制方法按照附录A中A.2）洗下菌液，调整菌含量至1.0 ×1010CFU/mL。
7.6.2.2
菌液灭活及疫苗制备
向三种菌液中分别加入终浓度为0.2 %的甲醛溶液，37 ℃灭活24 h后，将菌液分成2份。1份灭活菌液与等体积的弗氏完全佐剂混合充分乳化，制成弗氏完全佐剂灭活疫苗。另1份灭活菌液与等体积的弗氏不完全佐剂混合充分乳化，制成弗氏不完全佐剂灭活疫苗。
7.6.2.3
动物免疫
挑选3 ~ 4月龄的健康SPF兔15只，分为3组。第一组为副猪格拉菌血清4型标准菌株免疫组，第二组为副猪格拉菌血清5型标准菌株免疫组，第三组为副猪格拉菌血清13型标准菌株免疫组。免疫方法为：首先用弗氏完全佐剂灭活疫苗进行免疫，免疫5只SPF兔，每只兔多点注射免疫（两后腿足部、背部皮下），4.0mL/只。2周后再用弗氏不完全佐剂灭活疫苗进行免疫，每只兔背部皮下多点注射，4.0mL/只。
7.6.2.4
活菌接种
弗氏不完全佐剂灭活疫苗免疫2周后，每只兔静脉注射1.0 × 108 CFU/mL活菌液1.0 mL，间隔2日后，继续静脉注射1.0 × 108 CFU/mL活菌液1.0 mL，连续5次。
7.6.2.5
阳性血清的收集
最后1次静脉静脉注射9 ~ 12日后，采血检测血清的抗体水平。取制备好的96孔板，以未免疫的SPF兔血清为阴性血清作对照。经琼脂扩散试验检测，副猪格拉菌血清4型、5型和13型血清抗体效价≥1:32的SPF兔，通过颈动脉放血收集血清，置于-70 ℃保存；经检测免疫不合格的SPF兔则在间隔一个星期后再用活菌液连续静脉注射3次，采血分离血清，再次检测血清的抗体效价，免疫效价低于1:32的SPF兔，可用活菌液连续静注3次以上，直至血清效价符合要求即可，将SPF兔放血收集血清。
7.7 微量凝集抗体检测操作
7.7.1 微量凝集抗体检测反应体系
T/CVMA 202—2024
4
微量凝集抗体检测反应体系详见表1。
表1 微量凝集抗体检测方法的反应体系
组分
1个检测反应的加入量（μL）
稀释液
50.0
待检血清 / 阳性血清/ 阴性血清
50.0
抗原
50.0
7.7.2 微量凝集反应操作
取96孔V形微量反应板，向所有孔中各加稀释液50 μL，然后在第1列孔中分别依次加入待检血清、阳性血清或阴性血清各50 μL，充分混匀后依次作2倍系列稀释至第11列孔，从第11列各孔中吸取50 μL混合液，弃去，第12列孔不加血清作为空白对照。每个血清样品进行3个平行重复。每孔加入抗原50 μL，微量振荡器混匀，加封盖膜，置37 ℃孵育24 h。
7.8 结果判定
7.8.1 试验成立条件
当阳性血清对照出现（++）以上，阴性血清无凝集沉淀时，试验方可成立。
7.8.2 结果判定
以出现50 %凝集（++）的血清最高稀释度作为待检血清的微量凝集抗体效价，详见表2。
表2 结果判定
序号
凝集值
结果判断
1
-
抗原全部沉积于孔底中央，呈光滑的大圆点。
2
+
少量抗原凝集，孔底中央抗原沉积成大圆点，但其周围不光滑。
3
++
抗原50%凝集，在孔底形成的薄膜边缘呈锯齿状，孔底中央抗原沉积成小圆点。
4
+++
抗原75%凝集，形成的薄膜铺满孔底，但孔底中央少量抗原沉积成针尖大小的圆点。
5
++++
抗原100%凝集，形成的薄膜均匀地铺满孔底，强凝集时，凝集皱缩成团。
T/CVMA 202—2024
5
附 录 A （规范性） 溶液配置
A.1 平衡盐溶液
A.1.1 母液A配制
称取160 g 氯化钠、8 g 氯化钾、2 g 硫酸镁、2 g 氯化镁和2.8 g 氯化钙，溶于800 mL去离子水中，加去离子水定容至1 L，4 ℃保存。
A.1.2 母液B配制
称取1.2 g磷酸二氢钾、3.04 g磷酸氢二钠、20 g葡萄糖，溶于800 ml去离子水中，最后加入100 mL 0.4 %酚红溶液。加去离子水定容至1 L，4 ℃保存。
A.1.3 配制平衡盐溶液
取母液A、B各1份，去离子水18份，混匀后分装，120 ℃高压蒸汽灭菌20 min，4 ℃保存。使用前，用无菌7 %碳酸氢钠溶液调平衡盐溶液pH值至7.2 ~ 7.6。
A.2 培养基
胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）为市售培养基，配制方法按照说明书进行；高压后的培养基温度降至50℃左右，按体积加入5%无菌牛血清和0.01%NAD，混匀后即为培养副猪格拉菌所需要的培养基。
A.3 PBS溶液
称取磷酸二氢钾0.27 g、无水磷酸氢二钠1.42 g、氯化钠8 g、氯化钾0.2 g，加灭菌水约800 mL充分搅拌溶解，定容至1000 mL，加入盐酸调pH值至7.2。