T/CVMA 203-2024 牛冠状病毒感染诊断技术 ,该文件为pdf格式 ,请用户放心下载!
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CCS B 41
团体标准
T/CVMA 203—2024
牛冠状病毒感染诊断技术
Diagnostic techniques for bovine coronavirus infection
2024 - 12 - 4发布2024 - 12 - 4实施
中国兽医协会发布
前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由青岛市动物疫病预防控制中心提出。
本文件由中国兽医协会归口。
本文件主要起草单位:青岛市动物疫病预防控制中心、中国动物卫生与流行病学中心、青岛博霖生物科技有限公司。
本文件主要起草人:李彦、吴发兴、杨胜男、段笑笑、马帅、尹斐斐、迟田英、李博文、邴啟政、赵永达、刘枢清。
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牛冠状病毒感染诊断技术
1 范围
本文件规定了牛冠状病毒感染的临床诊断、样品采集与处理、病毒分离、RT-PCR、荧光RT-PCR、间接酶联免疫吸附试验技术要求。
本文件适用于肉牛、奶牛以及其他易感动物牛冠状病毒感染的诊断、检测、监测和流行病学调查等。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室生物安全通用要求
GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫
NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BCoV:牛冠状病毒(Bovine coronavirus)
CPE:致细胞病变(Cytopathic effect)
ELISA:酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay)
FBS:胎牛血清(Fetal Bovine Serum)
HRP:辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase)
HRT-18细胞:人直肠肿瘤18细胞(Human Rectal tumor-18 cell)
MEM:最低必需培养基(Minimum essential medium)
PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline buffer)
RNA :核糖核酸(Ribonucleic acid)
RT-PCR:反转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction)
TMB:四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-tetramethyl-benzidine)
5 病毒学
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牛冠状病毒属于冠状病毒科冠状病毒属的单股正链RNA病毒。成熟的病毒粒子具有多形性,基本呈球形,直径为65 nm ~210 nm,平均直径约120 nm。病毒结构形态为复合结构,最外层为囊膜,囊膜上存在较长的纤突蛋白和较短的血凝素酯酶蛋白,内部为多面体对称。
6 临床诊断
6.1 流行病学
6.1.1 牛为自然宿主,除了感染奶牛、肉牛外,牦牛、水牛等也能感染。
6.1.2 患病牛和带毒牛是本病的主要传染源。
6.1.3 主要通过消化道和呼吸道传播,也可通过接触传播。
6.1.4 犊牛潜伏期一般为1 d ~ 2 d,成年牛为2 d ~ 3 d。痊愈牛体内有该病毒抗体,可以产生长达1~3年的免疫力。但由于痊愈牛仍可在一段时间内通过鼻腔分泌物或粪便持续排毒,成为病毒携带者,易导致同舍(群)易感牛被感染。
6.2 临床症状
6.2.1 犊牛腹泻多发于10日龄以内的犊牛,大多数犊牛出现出血性腹泻或黄色水样腹泻,伴有粘液、进行性脱水、低温和精神沉郁,饲料摄入量不足和电解质流失还可以造成犊牛血糖降低和代谢性酸中毒。腹泻特别严重而不治疗的动物则会出现昏迷甚至死亡。
6.2.2 成年牛冬季血痢主要见于产后成年奶牛,一般在冬季较为严重,特点是出现自限性水样腹泻暴发,并伴有出血性腹泻、频繁的呼吸症状、产奶量和奶品质下降,病情严重可导致贫血。
6.2.3 牛冠状病毒还可以与其他多种病原体共同导致牛呼吸道综合征,临床表现为呼吸困难、咳嗽、鼻炎、肺炎、体重减轻和流鼻涕等。
6.3 病理变化
肠道剖检内容物可见黏液样物质,有时可见凝乳小块。急性病例可见肠道肿大,病理切片可见肠绒毛萎缩,部分肠绒毛融合粘连,固有层可见炎性细胞浸润。呼吸道综合征犊牛肺部一般无明显病变。部分患病动物可见纤维素渗出性坏死性肠炎,以及淋巴结出现水样肿大。
6.4 鉴别诊断
临床多见牛冠状病毒与其他病原体混合感染。冠状病毒和轮状病毒都会导致犊牛腹泻,但是冠状病毒感染时会同时侵袭大肠和小肠,所以更为严重。一旦犊牛混合感染病毒和细菌后,表现出明显的呼吸道综合征。成年牛冬季血痢在诊断时要注意和牛病毒性腹泻、球虫和沙门氏菌引起的腹泻相区别。
6.5 结果判定
符合6.1、6.2、6.3,可判定为牛冠状病毒病临床疑似病例,确诊应采样进行实验室诊断。
7 样品的采集与处理
7.1 通则
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应选择具有典型临床症状的动物进行采样,采样过程中不应交叉感染,每采集一个样品宜更换或消毒一次灭菌采样器具。样品采集、处理、保存和运输应符合GB 19489和NY/T 541的要求。
7.2 拭子样品
7.2.1 活畜可采集鼻咽拭子和肛门拭子,要求可见明显黏液。发生腹泻的牛可将拭子伸入肛门旋转一圈刮取新鲜粪便,或者刚排出的新鲜粪便。分别放入盛有0.5 mL PBS溶液的1.5 mL离心管中,编号。
7.2.2 将采集的拭子样品在振荡器上充分混合,反复冻融1次~ 2次,在4 ℃ 12000 r/min 离心10 min,取上清液滤过除菌后转入无菌1.5 mL离心管中,编号备用。
7.3 组织样品
7.3.1 用无菌剪刀和镊子采集病死牛部分气管和肺、肠道、淋巴结等组织,或一小段小肠及内容物样品,放入无菌密封袋或采样管内,编号。
7.3.2 取少量样品置组织匀浆器充分研磨,加入适量PBS溶液制成混悬液,反复冻融1次~2次,在4℃ 12000 r/min 离心10 min,取上清液滤过除菌后转入无菌1.5 mL离心管中,编号备用。
7.4 血清样品
7.4.1 用一次性非抗凝采血管经尾静脉采集全血,不少于5 mL/头,
7.4.2 3000 r/min 离心10 min,无菌分离血清,将血清装入1.5 mL离心管中,编号备用。
7.5 样品运输与保存
样品密封后置保温箱中,低温2℃ ~ 8 ℃ 24 h内送至实验室。若需长期保存,应放置于-70 ℃以下条件保存。
8 病毒分离
8.1 器材
8.1.1 倒置生物显微镜。
8.1.2 冰箱(2 ℃ ~ 8 ℃、-20℃和-70℃)。
8.1.3 CO2培养箱(37 ℃)。
8.1.4 96孔细胞培养板。
8.1.5 T25细胞培养瓶。
8.1.6 低温高速离心机。
8.2 试剂
8.2.1 HRT-18细胞,或者Vero细胞。
8.2.2 0.25%胰酶。
8.2.3 细胞培养液与细胞维持液,配方见附录A中A.1和A.2。
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8.2.4 PBS缓冲液(pH 7.4),配方见附录A中A.3。
8.3 操作程序
8.3.1 制备单层细胞:按常规法将HRT-18细胞或Vero分装在T25细胞培养瓶中,分散浓度为1×106个/mL ~2×106个/mL,置于37 ℃ 5 % CO2培养箱中培养24 h ~ 48 h。随时观察细胞生长情况,待细胞长成单层备用。
8.3.2 接种细胞:将处理后的样品用细胞维持液制成1:5悬液,旋涡振荡器混匀,3000 r/min 4 ℃离心10 min取上清液,添加质量浓度为20 μg/mL ~ 30 μg/mL胰酶,37 ℃水浴激活1 h。每份样品接种2 ~ 4瓶细胞,另设置细胞对照2 ~ 4瓶。接种前,先倒去培养瓶中营养液,按细胞维持液终体积的10%加入处理好的样品,37℃吸附1 h,补加含有15 μg/mL~25 μg/mL胰酶的细胞维持液。细胞对照瓶不接种样品,倒去营养液后加入等量细胞维持液。均置于37℃ 5% CO2培养箱中进行培养,逐日观察细胞病变情况。
8.3.3 盲传:在接种样品继续培养4 d~5 d时无论是否产生CPE,收获全部细胞培养物,冻融1次~2次,4 ℃ 8000 r/min离心5 min,取上清按上述方法继续接种细胞进行盲传,一般盲传5个代次,收获各代次全部细胞培养物,置-70 ℃以下保存备用。
8.4 病毒鉴定
对出现CPE的细胞培养物,采用第9章或第10章所述方法进行核酸鉴定,必要时送样测序。
8.5 结果判定
8.5.1 对出现CPE的细胞培养物,经8.4所述任一方法检测阳性者,判为病毒分离阳性。
8.5.2 盲传5代,未出现CPE的细胞培养物,且经8.4所述任一方法检测阴性者,判为病毒分离阴性。
9 RT-PCR
9.1 器材
9.1.1 PCR扩增仪。
9.1.2 台式高速冷冻离心机。
9.1.3 BSL-2级生物安全柜。
9.1.4 稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。
9.1.5 紫外凝胶成像仪。
9.1.6 各种规格的移液器、离心管和PCR扩增管。
9.2 试剂
9.2.1 RNA提取试剂:Trizol,或商品化RNA提取试剂盒。
9.2.2 RT-PCR相关试剂:采用一步法,可选择商品化的One-step RT-PCR试剂盒;采用两步法,可选商品化的反转录试剂盒、2×Taq 酶预混液。
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9.3 操作程序
9.3.1 病毒RNA提取:将采集的样品和细胞培养物进行处理,按照商品化RNA提取试剂盒方法提取核酸。RNA提取应保证无细菌及核酸污染,置-70 ℃以下保存或立即使用。
9.3.2 引物:参考GenBank收录的BCoV AKS-01株(KU886219)E基因序列,设计BCoV荧光定量RT-PCR引物及检测探针,序列信息见附录B.1。
9.3.3 反应体系配制:采用25 μL反应体系,扩增体系配制如下。
a
) 一步法:在冰盒上配制反应体系,取模板2 μL、上游和下游引物各1 μL(10 μmol/L)、One-step 酶促反应预混液12.5 μL、RNase-Free H2O 8.5 μL,混匀后瞬时离心,按9.3.4节中的一步法进行检测。
b
) 两步法:在冰盒上配制反应体系,取9.3.2节中的下游引物(10 μmol/L)、9.3.1节提取的RNA按反转录试剂盒使用说明书配制反转录体系;获得cDNA后配制PCR扩增体系,包括cDNA 2 μL、上游和下游引物各1 μL(10 μmol/L)、2×Taq 酶预混液12.5 μL,RNase-Free H2O 8.5 μL,混匀后瞬时离心,按9.3.4节中的两步法进行检测。
9.3.4 扩增程序:将PCR扩增管盖盖紧,放入扩增仪中按下列程序进行扩增。
a
) 一步法:50 ℃反转录30 min,95 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45s,共35个循环;72 °C延伸10min,4 °C保存扩增产物。
b
) 两步法:先进行反转录反应,程序为50 ℃ 60 min(反转录温度根据酶的不同进行设定)、70℃ 灭活15 min,获得cDNA,再进行PCR扩增,程序为95 ℃预变性5 min,94 ℃变性30s、55℃退火30 s,72 ℃延伸45s,进行35个循环;72 °C延伸10 min,4 °C保存扩增产物。
9.3.5 扩增产物电泳检测:制备1 %琼脂糖凝胶,取5 μL PCR扩增产物加入加样孔,设置标准DNA Maker、阴性对照和阳性对照,于1×TAE电泳缓冲液中进行电泳,凝胶成像仪观察结果。
9.4 结果判定
9.4.1 阳性对照出现255 bp左右的扩增条带,阴性对照无扩增条带,则实验成立。
9.4.2 在实验成立的前提下,如检测样品出现255 bp左右的目的片段(与阳性对照大小相符),判为牛冠状病毒核酸阳性;检测样品未出现目的片段,判为牛冠状病毒核酸阴性。
10 荧光RT-PCR
10.1 器材
10.1.1 荧光定量PCR仪。
10.1.2 台式高速冷冻离心机。
10.1.3 BSL-2生物安全柜。
10.1.4 各种规格的移液器、离心管、平顶且透光的PCR扩增管或8联排PCR管或96孔PCR板。
10.2 试剂
除一步法荧光RT-PCR试剂盒外,其他试剂同9.2。
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10.3 引物和探针
参考GenBank收录的BCoV AKS-01株(KU886219)N基因序列,设计BCoV荧光定量RT-PCR引物及检测探针,序列信息见附录B.2。
10.4 操作程序
10.4.1 病毒RNA提取:按9.3.1执行。
10.4.2 荧光RT-PCR反应体系配制:采用20 μL反应体系,扩增体系配置如下。Premix Ex Taq(Probe qPCR)10 μL,探针0.3 μL(10 μmol/L),上游和下游引物各0.3 μL(20 μmol/L),模板1 μL,用RNase-Free H2O补足到20 μL。
10.4.3 扩增程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,进行40个循环。
10.5 试验成立条件
10.5.1 阳性对照扩增曲线应呈标准的S曲线,且Ct值应小于26。
10.5.2 阴性对照无Ct值且无扩增曲线。
10.6 结果判定
被检样品Ct值<36,出现典型S形扩增曲线,判为BCoV核酸阳性。无Ct值判为BCoV核酸阴性。当36≤Ct值≤40,判为可疑,应重新检测,如再次出现典型扩增曲线,且Ct值≤40,判为BCoV核酸阳性。
11 间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)
11.1 器材
11.1.1 酶标仪。
11.1.2 96孔平底微量酶标板。
11.1.3 恒温培养箱。
11.1.4 水平旋转振荡器。
11.1.5 封板膜。
11.2 试剂
11.2.1 牛冠状病毒阳性血清(中和效价1:512)、牛冠状病毒阴性血清,由制标单位提供,或者向专业试剂公司购买。
11.2.2 牛冠状病毒重组N蛋白抗原,抗原的制备见附录C。
11.2.3 HRP标记的山羊抗牛IgG。
11.2.4 PBS缓冲液、PBST洗涤液、包被液、封闭液、终止液,配置方法见附录A。
11.2.5 商品化TMB显色液。
11.3 操作程序
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11.3.1 包被酶标板:使用磷酸盐缓冲液稀释经体外表达、纯化、鉴定正确的BCoV N蛋白,终浓度为1.5 μg/mL,按100 μL/孔的量进行抗原包被,置在2 ℃ ~ 8 ℃环境下过夜。
11.3.2 洗涤:弃掉包被液,每孔加入200 μL洗涤液,放置1 min后弃去,重复3次~ 5次,用吸水纸拍干。
11.3.3 封闭:每孔加入200 μL 5 %的山羊血清(封闭液)进行封闭,置于37 ℃温箱内作用2 h。
11.3.4 第一次洗涤:弃掉封闭液,同11.3.2洗涤。
11.3.5 加待检血清和对照血清:加入用PBS缓冲液1:50稀释的待检血清和标准对照血清,100 μL/孔,置于37℃温箱内作用90 min。
11.3.6 第二次洗涤:弃掉液体,同11.3.2洗涤。
11.3.7 加酶标抗体:加入1:10000稀释的HRP标记的山羊抗牛IgG,100 μL/孔,置于37 ℃温箱内作用60 min。
11.3.8 第三次洗涤:弃掉液体,同11.3.2洗涤。
11.3.9 显色:加入TMB显色液,100 μL/孔,置于37℃温箱内避光显色10 min。
11.3.10 终止:加入终止液,100 μL/孔。
11.3.11 读数:用酶标仪读取反应板各孔450 nm下读数并判定结果。
11.1 结果判定
11.1.1 试验成立条件:阳性对照血清的平均OD450>0.26,阴性对照血清平均OD450<0.20时,试验结果有效;否则,应重新进行试验。
11.1.2 判定:待检血清的OD450nm值≥0.256判为阳性,待检血清的OD450nm值<0.256判为阳性。
12 综合判定
12.1 临床判定为疑似的易感动物,经第8章(病毒分离)分离出牛冠状病毒,或经第9章(RT-PCR)、10章(荧光RT-PCR)任一项检测出BCoV核酸阳性的,可判定为牛冠状病毒感染。
12.2 临床无明显特异症状的非免疫动物经第11章(间接ELISA)检测出牛冠状病毒抗体阳性的,可判定该动物曾经感染过牛冠状病毒。
12.3 临床无明显特异症状的同群或具有流行病学相关性的易感动物,经采血分离血清或棉拭子、组织样品经第8章、第9章、第10章任一项检测为阳性的,可判定为牛冠状病毒感染。
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附 录 A (规范性) 试剂的配制
A.1 细胞培养液
DMEM培养基 44.5 mL
FBS 5 mL
青霉素(10000 U/mL)-链霉素(10000 μg/mL) 500 μL
混匀后,2 ℃ ~ 8 ℃密封保存,现配现用。
A.2 细胞维持液
DMEM培养基 44.5 mL
胰酶 0.25 g/mL
青霉素(10000 U/mL)-链霉素(10000 μg/mL) 500 μL
混匀后,2 ℃ ~ 8 ℃密封保存,现配现用。
A.3 PBS缓冲液
NaCl 8 g
KCl 0.2 g
Na2HPO4 1.42 g
KH2PO4 0.27 g
加入去离子水约800 mL,充分搅拌溶解,调节pH至7.4,定容至1 L,高压灭菌后2℃~8 ℃保存。
A.4 PBST缓冲液
NaCl 8 g
KCl 0.2 g
Na2HPO4 1.42 g
KH2PO4 0.27 g
加入去离子水约800 mL,充分搅拌溶解,调节pH至7.4,定容至1 L,高压灭菌后降至室温,加入500 μL Tween-20,2 ℃ ~ 8 ℃保存。
A.5 包被液
Na2CO3 1.59 g
NaHCO3 2.93 g
加入去离子水约800 mL,充分搅拌溶解,调节pH至9.6,定容至1 L,2 ℃ ~ 8 ℃保存。
A.6 封闭液
在100mL PBST中加入终浓度为5 %的山羊血清即可。
A.7 终止液
H2SO4 21.8 mL
定容至200 mL,常温保存。
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附 录 B (资料性) RT-PCR引物和荧光RT-PCR引物和探针
B.1 RT-PCR检测引物
RT-PCR检测引物见表B.1。
表B.1 牛冠状病毒RT-PCR检测引物
引物名称
引物序列(5’→ 3’)
产物大小
基因
BCoVTF
ATGTTTATGGCTGATGCTTATTTTG
255 bp
E
BCoVTR
CTAAACGTCATCCACATCAAGAACT
B.2 荧光RT-PCR检测引物和探针
荧光RT-PCR检测引物序列见表B.2。
表B.2 牛冠状病毒荧光定量RT-PCR检测引物和探针
引物名称
引物序列(5’→ 3’)
产物大小
基因
BCoV-NF
CAATCCAGTAGTAGAGCGTCCT
142 bp
N
BCoV-NR
CTGGTTGCTGAGAAGTGACAGT
BCoV-Probe
FAM-TGCCAAAGACCAGTATGGCACCGA-BHQ1
B.3 引物和探针的稀释
开盖前,将新合成的引物或探针进行瞬时离心(12 000 r/min,30s);用DEPC处理水溶解,加水量为10×总纳摩尔数,充分混匀,此时引物或探针的浓度为100 μmol/L,可作为储存液,-20 °C或以下温度保存;使用时,将100 μmol/L的引物或探针储存液用DEPC处理水配制浓度为20 μmol/L(RT-PCR)或10 μmol/L(荧光RT-PCR)的使用液,-20 °C或以下温度保存。
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附 录 C (规范性) 抗原制备
对牛冠状病毒的N基因的主要抗原区域(序列如下)进行克隆,将目的片段与表达载体pET-28a连接并测序,随后转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG在37℃条件下诱导表达6 h,离心回收菌体,经超声破碎、离心取沉淀,用镍柱法纯化重组N蛋白,纯化的重组N蛋白,经尿素透析后获得具有生物活性的N蛋白,-80℃分装保存、备用。
BCoV N基因表达片段序列:
ATGTCTTTTACTCCTGGTAAGCAATCCAGTAGTAGAGCGTCCTCTGGAAATCGTTCTGGTAATGGTATCCTTAAGTGGGCCGATCA
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