T/CVMA 204-2024 猪非典型瘟病毒病诊断技术

ICS 11.220
CCS B 41
团体标准
T/CVMA 204—2024
猪非典型瘟病毒病诊断技术
Diagnostic technique of atypical porcine pestivirus disease
2024 – 12 - 4发布2024 -12 - 4实施
中国兽医协会发布

前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由青岛市动物疫病预防控制中心提出。
本文件由中国兽医协会归口。
本文件起草单位：青岛市动物疫病预防控制中心、青岛农业大学、青岛博霖生物科技有限公司、新光瑞合（青岛）生物科技有限公司。
本文件主要起草人：李彦、赵永达、郭莉莉、杨胜男、段笑笑、尹斐斐、马帅、邴啟政、刘枢清、江强世、柳妍玲、曹志、付来宇、厉博雅、王守杰。

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猪非典型瘟病毒病诊断技术
1 范围
本文件规定了猪非典型瘟病毒临床诊断、RT-PCR、荧光RT-PCR及ELISA抗体检测方法的技术要求。
本文件适用于猪非典型瘟病毒流行病学调查、诊断、检疫及病原鉴定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室生物安全通用要求
GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫
NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
APPV：猪非典型瘟病毒（atypical porcine pestivirus）
PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline buffer)
PCR：聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）
RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction）
荧光RT-PCR：反转录-荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative reverse transcription PCR）
5 临床诊断
5.1 病原学
猪非典型瘟病毒（APPV）主要感染猪。病原学为：APPV属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus），为单股正链RNA病毒。APPV 基因组全长11~12 kb（11475 bp、11526 bp），包括5'-UTR 和3'-UTR 非编码区及1个多聚蛋白阅读框。根据最新的进化趋势，国际病毒分类委员会于2017年发布的分类指南中，将瘟病毒属划分为11个分支（A-K），而APPV为瘟病毒属K（Pestivirus K）的代表毒株。
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5.2 临床症状
5.2.1 该病主要发生于新生仔猪，以四肢、头部或全身出现有节奏的震颤为临床特征，成年猪多呈隐性感染，发病仔猪的死亡率高。该病具有传染性和遗传性。
5.2.2 仔猪均有不同程度的颤抖现象，且消瘦、行动迟缓，无法吸吮乳汁，但无瘫痪，发病率60％左右，死亡率超过60 %。
5.2.3 部分未死亡的仔猪转到保育栏仍有颤抖，持续约2个月逐渐平稳。
5.3 剖检病变
病死猪喉头出血，肾脏点状出血，大部分病死猪的肠系膜淋巴结呈乳白色；其他组织器官无明显病理变化。
5.4 结果判定
出现5.2、5.3的情况，初步判定为猪非典型瘟病毒临床疑似病例，需要进一步开展实验室诊断。
6 样品采集、保存、运输和处理
6.1 组织样品采集
无菌采集病死猪脏器组织（如颌下淋巴结、腹股沟淋巴结、脑、心、肝、脾、肺、肾等），装入无菌采样袋或一次性灭菌的15 mL或50 mL离心管并编号；或采集疑似感染病猪的血液并编号。
6.2 保存和运输
样品采集后应冷链运输，并于24 h内送达实验室。样品应尽快处理，在2 ℃ ~ 8 ℃保存宜不宜超过24 h；如超过24 h需冷冻保存。如无法冷链运输，应将样品置于含10 %甘油的平衡盐溶液（配制方法按照附录A中A.1）中运输。
6.3 样品处理
6.3.1 组织样品处理
猪的脏器组织（如颌下淋巴结、腹股沟淋巴结、脑、心、肝、脾、肺、肾等），剪碎、研磨或匀浆，按1 g组织加10 mL DEPC水（配制方法按照A.2）的比例配成悬液，8000 r/min 低温离心5min，取上清液作为核酸检测材料。
6.3.2 血清样品处理
采集后的血液4000 r/min离心10 min，吸出上层血清，作为核酸检测材料。
7 RT-PCR
7.1 仪器设备
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7.1.1 PCR扩增仪。
7.1.2 高速冷冻离心机（最大离心力在12000g以上）。
7.1.3 核酸电泳仪和水平电泳槽。
7.1.4 微量移液器（量程：0.5 μL ~ 10 μL、2 μL ~ 20 μL、20 μL ~ 200 μL和200 μL ~ 1 000 μL）。
7.1.5 凝胶成像系统或紫外透射仪。
7.2 试剂与材料
7.2.1 50 TAE贮存液，配制方法按照附录A中的A.3。
7.2.2 1% 琼脂糖凝胶，配制方法按照A.4。
7.2.3 PBS溶液，配制方法按照A.5。
7.2.4 样品：待检猪脏器悬液与阳性对照APPV病死猪淋巴结悬液。
7.2.5 一步法RT-PCR试验用引物和检测靶基因序列，见附录B中B.1和B.2。
7.3 病毒RNA核酸提取
采用RNA Extraction Kit（也可用其他等效商品化试剂替代）对APPV进行RNA提取，-20℃保存备用。
7.4 阴性对照和阳性对照制备
将病原保守区域的基因序列送公司进行合成，并克隆到pMD19-T载体上。重组质粒测定浓度后，计算获得DNA拷贝数，随后进行十倍比稀释，作为阳性对照，存放于-80 ℃。阴性对照为无菌无酶水。
7.5 RT-PCR扩增
以7.3提取的RNA为模板，建立一步法RT-PCR 检测方法。扩增体系如下：Step Enzyme Mix 2μL；2 1 Step Buffer 25μL；F/R（10 μmol/L）：1 μL；RNA：1 μL；加水至50 μL；PCR反应条件：50℃反转录30min，94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1min ，35个循环；72 ℃延伸10 min（见附录C）。
7.6 结果观察
将PCR扩增产物经1 %琼脂糖凝胶进行电泳，电压120 V，时间30 min，在凝胶成像系统或紫外透射仪中观察结果并拍照。
7.7 结果判定
APPV阳性对照扩增条带预期大小为633 bp，阴性对照、空白对照无相应的目的条带的情况下试验成立。检测样品出现与阳性对照相同的目的条带，则判定为APPV核酸阳性，否则判定为阴性。
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8 荧光RT-PCR
8.1 仪器设备
8.1.1 实时荧光PCR扩增仪。
8.1.2 其他设备同7.1。
8.2 试剂与材料
8.2.1 引物，见附录D。
8.2.2 样品：待检猪脏器悬液与阴阳性对照。
8.2.3 其他同7.2。
8.3 RNA提取
同7.3。
8.4 阴性对照和阳性对照制备
同7.4。
8.5 荧光RT-PCR检测
以8.3提取的RNA为模板，建立荧光RT-PCR检测方法。荧光RT-PCR引物及探针见附录D中的D.1。荧光RT-PCR检测反应体系按附录D中的D.2配制。荧光RT-PCR反应参数按附录D中的D.3设置，荧光通道为FAM通道。
8.6 结果观察
试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
8.7 结果判定
阳性对照Ct值≤35且扩增曲线有明显对数增长期，同时阴性对照扩增曲线无对数增长期的情况下，试验成立。检测样品的Ct值≤35，且出现标准的S形扩增曲线，判为阳性，即存在APPV核酸；无Ct值，扩增曲线不起峰，判为阴性，即样品中不存在APPV核酸。当检测样品35˂Ct≤40，且扩增曲线出现标准的S形曲线，判为可疑，需进行一次重复试验，如重复后仍为上述结果，判为阳性。
9 ELISA抗体检测方法
9.1 仪器设备
9.1.1 酶标仪。
9.1.2 8联排移液器。
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9.2 试剂与材料
9.2.1 试剂详见附录E。
9.2.2 样品：待检猪血清与阳性对照APPV血清。
9.3 ELISA操作程序
9.3.1 包被：使用包被缓冲液将APPV E2重组蛋白稀释至10 μg/mL，每孔加100 μL。置于2 ℃ ~ 8 ℃包被16 h。
9.3.2 第一次洗板：弃去包被液，每孔加入280 μL ~ 300 μL的洗涤液，洗板2次。每次洗涤后应弃去孔内的液体。最后一次洗涤液弃去后，在吸水纸上拍干。
9.3.3 封闭：每孔加入100 μL、5 %封闭液，于37 ℃保温箱封闭2 h。
9.3.4 第二次洗板：弃去封闭液，每孔加入280 μL ~ 300 μL的洗涤液，洗板3次，每次5 min，弃去洗涤液，并在吸水纸上拍干。
9.3.5 干燥：置于37 ℃干燥3 h ~ 5 h。装入铝箔袋，加干燥剂，抽真空，置于2 ℃ ~ 8 ℃保存备用。
9.3.6 稀释：将包被板和待检血清室温放置30 min，用样品稀释液100倍稀释待检样品。
9.3.7 加样：取出包被板，所有检测孔中加入稀释后的100 μL样品、阴性对照、阳性对照。对照孔每次检测两孔，振荡混合均匀。
9.3.8 温育：置37 ℃恒温培养箱中温育2 h。
9.3.9 第三次洗板：将各孔的液体弃入废液筒，用280 μL ~ 300 μL洗涤液洗涤板孔，共洗涤5次。每次洗涤后应弃去孔内的液体。最后一次洗涤液弃去后，在吸水纸上拍干。
9.3.10 加酶结合物：兔抗猪酶标抗体100 μL，37 ℃孵育1 h用酶结合物稀释液将HRP酶标记的抗羊二抗稀释至工作浓度，每孔加入100 μL。
9.3.11 温育：置37 ℃恒温培养箱中温育（30±1） min。
9.3.12 洗板：将各孔的液体弃入废液筒，用280 μL ~ 300 μL洗涤液洗涤板孔，共洗涤3次。每次洗涤后应弃去孔内的液体。最后一次洗涤液弃去后，在吸水纸上拍干。
9.3.13 加入底物：每孔加入100 μL底物显色液。
9.3.14 温育：置37 ℃恒温培养箱中温育（15±1）min。
9.3.15 终止和读值：每孔加入终止液50 μL。酶标仪测量并且记录样品和对照的OD值(450nm)，15 min内读值有效。
9.3.16 S/P值按公式（1）进行计算：
S/P=（ODS-ODNC）/（ODPC-ODNC）…………………………………………（1）
式中：
S/P——样品数值；
ODS——待检血清样品在450 nm波长处的OD值；
ODPC——阳性对照血清在450 nm波长处的平均OD值；
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ODNC——阴性对照血清在450 nm波长处的平均OD值。
9.4 试验成立条件
ODNC值<0.3，且ODPC值>0.4，试验结果有效；否则，应重新进行试验。
9.5 结果判定
在试验成立的前提下，S/P值＞0.4判为阳性；S/P值< 0.4判为阴性。
10 综合判定
符合5.2、5.3或9试验阳性，判定疑似APPV感染；符合5.2、5.3或9试验，且7 或8结果为阳性，判定为APPV感染。
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附 录 A （规范性） 试剂的配制
A.1 平衡盐溶液
A.1.1 母液A配制
称取160 g 氯化钠、8 g 氯化钾、2 g 硫酸镁、2g 氯化镁和2.8g 氯化钙，溶于800 mL去离子水中，加去离子水定容至1 L，4 ℃保存。
A.1.2 母液B配制
称取1.2 g磷酸二氢钾、3.04 g磷酸氢二钠、20 g葡萄糖，溶于800 ml去离子水中，最后加入100 mL 0.4%酚红溶液。加去离子水定容至1 L，4 ℃保存。
A.2 DEPC水制备
向1000 mL蒸馏水中加入1 ml 0.1 %焦碳酸二乙酯（DEPC）；搅拌均匀，在室温下静置1 h；121 ℃高压30 min；使用前冷却至室温。
A.3 电泳缓冲液（TAE）
A.3.1 50×TAE贮存液的配制
分别称量Na2EDTA·2H2O 37.2 g、冰乙酸57.1 mL、Tris·Base 242 g，加灭菌双蒸水定容至1000 mL。或采用商品化的试剂。
A.3.2 1×TAE溶液的配制
取10 mL贮存液加490 mL蒸馏水即可。
A.4 1 %琼脂糖凝胶
1g琼脂糖干粉加到100mL TAE溶液中，沸水浴或微波炉加热至琼脂糖溶化，待凝胶稍冷却后加入溴化乙锭或替代品，终浓度为0.5 μg/mL。
A.5 PBS溶液(0.01 mol/L PBS，pH 7.0~7.2)
分别取KH2PO4 0.24 g、Na2HPO4 1.44 g、NaC18.0 g、KCl 10.2 g，加灭菌双蒸水定容至1000 mL，调节pH至7.0 ~ 7.2，2 ℃ ~ 8 ℃保存备用。或采用商品化的试剂。
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附 录 B （资料性） RT-PCR扩增引物和检测靶基因序列
B.1 RT-PCR扩增引物与序列
RT-PCR扩增引物序列见表B.1。
表B.1 引物的名称和序列
名称
基因
序列（5′- 3′）
APPV -F
E2 基因
AGCTGCATCAAACGTCAGGATTA
APPV -R
GTGACGGTACATGGTCGCCG
B.2 检测靶基因E2的核苷酸序列（GenBank:MW760398.1）
AGCTGCATCAAACGTCAGGATTACTACAACGTTCAGCTGGTTGTTGAAGAAAAAACCGGCGTTGAAAAACGTAGCATCATGGGCAAATGGACCGTTATCACCCGTGAAGGCCGTGAACCGCGTCTGAGGAACAGATCAAAGTTGTTAGCAACGAAAGCGTTCTGGAAACCTACTGCTACAACCGTCTGAACACCAGCAGCTGGGGCCGTCGTCCGATCCGTCAGCGTGGCTGCGGCCAGACCGTTCCGTACTGGCGGGCGATAACGTTCTGGAAGAACAGTACTACAGCATGGGCTACTGGGTTAACGCGACCGGCGGCTGCCAGCTGCGTGAAGGTGTTTGGCTGAGCCGTAAAGGTAACGTTCAGTGCCAGCGTAACGGAGCAGCCTGATGCTGCAGCTGGCGATCAAAGAAGATAACGATACCATGGAAATCCCGTGCGATCCGGTTGAAACCGAAAGCATGGGCCCGGTTGCGCAGGGCACCTGCGTTTACGGCTGGGCGGTTGGCCGCGTGGCTGGTACTACAACCGTAAAGATGGCTACTGGCTGCAGTACATCAAAAAGAACGATTACCAGTACTGGACCAAAATGCCGACCGCGAGCAGCGCGGCGACCATGTACCGTCAC
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附 录 C （规范性） RT-PCR反应
C.1 RT-PCR反应体系
一步法RT-PCR反应体系见表C.1。
表C.1 一步法RT-PCR反应体系
组分
1个检测反应的加入量（μL）
PrimeScript Step Enzyme Mix
2.0
2×1 Step Buffer（Dye Plus）
25.0
APPV-F (10 μmol/L)
1
APPV-R (10 μmol/L)
1
ddH2O
20
RNA
1.0
总体积
50.0
C.2 一步法RT-PCR反应程序
一步法RT-PCR反应程序见表C.2。
表C.2 一步法RT-PCR反应程序
温度
反应时间
循环数
50 ℃
30min
1
94 ℃
2min
1
94 ℃
30 s
35
56 ℃
30 s
72 ℃
1min
72 ℃
10 min
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附 录 D （规范性） 荧光RT-PCR引物序列、反应体系和反应参数
D.1 荧光RT-PCR引物序列及探针
荧光RT-PCR扩增引物及探针序列见表D.1。
表D.1 荧光RT-PCR试验用扩增引物序列
名称
基因
序列（5′- 3′）
APPV qPCR -F
E2 基因
5’-ACGTAGCATCATGGGCAAATGG -3’
APPV qPCR -R
5’-TGGTGTTCAGACGGTTGTAGCAGTA-3’
APPV-qPCR -Probe
FAM-ATGGACCGTTATCACCCGTGAAG-BHQ1
D.2 荧光RT-PCR检测反应体系
荧光RT-PCR检测反应体系见表D.2。
表D.2 荧光RT-PCR检测反应体系
组分
1个检测反应的加入量（μL）
2×5G qPCR Buffer BB
10.0
RT-qPCR Enzyme with UNG
1.0
APPV qPCR -F (10 μmol/L)
1.0
APPV qPCR -R (10 μmol/L)
1.0
APPV-qPCR -Probe (10 μmol/L)
0.4
ddH2O
4.6
RNA
2.0
总体积
20.0
D.3 荧光RT-PCR反应参数
荧光RT-PCR检测反应参数见表D.3。
表D.3 荧光RT-PCR反应参数
反应温度 (℃)
反应时间
循环数
37
2 min
1
52
5 min
1
95
1 min
40
95
10 s
60
20 s
60
5 min
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附 录 E （规范性） ELISA抗体检测试剂的制备
E.1 包被缓冲液
准确称取1.59 g碳酸钠、2.93 g碳酸氢钠，量取1000mL蒸馏水，使用搅拌器搅拌使其完全溶解，使用酸度计测定pH值（pH 9.6 ~ 9.8）。
E.2 封闭液
称取2.9 g磷酸氢二钠（含12个结晶水）、0.2 g磷酸二氢钾、8 g氯化钠、0.2 g氯化钾，量取1000mL蒸馏水，搅拌溶解，使用酸度计测定pH值（pH值7.2 ~ 7.4），再称取牛血清白蛋白20 g，蔗糖50 g，加入其中，搅拌溶解后，再加入0.5 mL ProClin300，0.5mL吐温-20，搅拌混匀。
E.3 酶结合物稀释液
加入2.9 g磷酸氢二钠（含12个结晶水）、0.2 g磷酸二氢钾、8 g氯化钠、0.2 g氯化钾，量取1000mL去离子水，搅拌溶解，使用酸度计测定pH值（pH值7.2 ~ 7.4），再称取牛血清白蛋白10 g加入其中，搅拌溶解后，再加入0.5mL ProClin-300，0.5mL吐温-20，搅拌混匀。
E.4 洗涤液
将14.9 g KH2PO4，79.1 g K2HPO4·3H2O，50.0 mL Tritonx-100，1.0 g NaN3，8.0 g NaCl溶于500 mL 水中，调pH为7.2，最终定容至1 L。
E.5 底物显色液
将4.2 g柠檬酸，13.6 g乙酸钠，0.5 g过氧化脲溶解在100 mL去离子水中，定容至1000 mL，调pH值为5.2，即为底物A液；将1 g TMB溶解于50 mL二甲基亚砜中，溶解后再加入100 mL甲醛，16.0 g聚乙烯吡咯烷酮，溶解后用去离子水定容至1 000 mL，即为底物B液。
E.6 样品稀释液
从LB培养平板上挑取大肠埃希氏杆菌BL21（E.coli BL21）单菌落，转接于含LB培养液的试管中，37 ℃培养过夜，制备菌液。将菌液转接到250 mL的LB培养基中，接种量为2 %，培养6 h。8000 r/min离心10 min。将菌体溶于50 mL PBS。将溶解的菌液解冻，超声波裂解。置8000 r/min，离心10 min，收集上清。用BCA蛋白含量检测试剂盒测定蛋白含量。然后将破碎菌液用0.01 mol/L、pH 7.2的PBS稀释至总蛋白含量为1 mg/mL。即为样品稀释液。
E.7 终止液
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配制2 mol/L的H2SO4，即为终止液。