SN/T 5663-2024 袋鼠疱疹病毒感染检疫技术规范 ,该文件为pdf格式 ,请用户放心下载!
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资源简介
ICS11.220
CCS B41
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T5663—2024
袋鼠疱疹病毒感染检疫技术规范
Quarantineprotocolformacropodidherpesvirusinfection
2024-12-31发布2025-07-01实施
中华人民共和国海关总署发布
前 言
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
请 注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位:中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国天津海关、中华人民共和国青岛海关。
本文件主要起草人:帅江冰、张晓峰、何永强、莫虹斐、曾若雪、金晨晨、陈小金、郑小龙、赵丹、张俊哲、
董志珍。
Ⅰ
SN/T5663—2024
袋鼠疱疹病毒感染检疫技术规范
1 范围
本文件规定了袋鼠疱疹病毒感染的聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光PCR检测方法的技术要求。
本文件适用于袋鼠疱疹病毒感染(见附录A)的检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T18088 出入境动物检疫采样
GB19489 实验室 生物安全通用要求
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件:
BHQ1:黑洞淬灭基团1(Blackholequencher1);
Ct:循环阈值(Cyclethreshold);
DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid);
dNTPs:三磷酸脱氧核苷酸(Deoxynucleosidetriphosphate);
FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein);
MaHV:袋鼠疱疹病毒(Macropodidherpesvirus);
PCR:聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction)。
5 实验室生物安全要求
样品处理及检测过程中所涉及的试验操作,应符合GB19489的有关规定。
6 试剂和材料
6.1 水:符合GB/T6682中一级水的要求。
6.2 灭菌生理盐水:配制方法见附录B中B.1。
6.3 Trizol裂解液。
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SN/T5663—2024
6.4 蛋白酶K溶液(20mg/mL)。
6.5 Tris饱和酚。
6.6 三氯甲烷。
6.7 异丙醇。
6.8 无水乙醇。
6.9 E×Taq 酶。
6.10 10× PCR缓冲液。
6.11 dNTPs(含dCTP、dGTP、dATP、dTTP)。
6.12 琼脂糖。
6.13 DNA 分子质量标准。
6.14 TAE电泳缓冲液:配制方法见B.2。
6.15 上样缓冲液:配制方法见B.3。
6.16 质控物质:阳性质控品为含MaHV 目的基因的质粒(序列参考信息见附录C);阴性质控品为不
含MaHV 的组织或血清。
6.17 PCR引物序列:
上游引物UL27-F2.3:5'-TGTTTCGCATGTTTGGTATG-3';
下游引物UL27-R2.3:5'-AAMCCCACAGTGTTCCACCC-3'。
引物用ddH2O 溶解至10μmol/L后,保存于-20℃备用。
6.18 荧光PCR引物和探针序列:
上游引物UL27-F1:5'-GGGAYTGGGTTCCCAAGAA-3';
下游引物UL27-R1:5'-TGGTMGTGAAGGTGGTRGATA-3';
探针序列UL27-probe:FAM-TGGCAAGAAGTCGATGAGATGCTCCG-BHQ1。
引物和探针分别用ddH2O 溶解至10μmol/L后,保存于-20℃备用。
7 仪器和设备
7.1 Ⅱ级生物安全柜
7.2 PCR仪。
7.3 荧光定量PCR仪。
7.4 分析天平(感量0.001g)。
7.5 漩涡振荡器。
7.6 台式冷冻离心机。
7.7 微量可调移液器:0.1μL~2.5μL、2μL~20μL、20μL~200μL、100μL~1000μL。
7.8 电泳仪。
7.9 凝胶成像系统。
8 样品采集与制备
8.1 根据GB/T18088确定采样动物数量。
8.2 鼻拭子:将棉拭子深入鼻腔深处,轻轻旋转拭子3圈~5圈,然后慢慢取出,将拭子放入盛有灭菌生
理盐水的采样管中。
8.3 血液样品:采用含有抗凝剂的真空采血管无菌采集袋鼠血液样品,4℃保存备用。
8.4 粪便或泄殖腔拭子:采集新鲜粪便样品,加入等体积灭菌生理盐水,振荡;将拭子深入泄殖腔转一
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SN/T5663—2024
圈并蘸取少量粪便,放入盛有2mL灭菌生理盐水的采样管中。3000r/min4 ℃离心10min,取上清
备用。
8.5 组织样品:无菌采集临床发病袋鼠的主要靶器官,称重1g加入适量灭菌生理盐水研磨匀浆,制成
20%悬液(质量浓度),冻融2次~3次,4000r/min4℃离心10min,取上清备用。
9 聚合酶链式反应(PCR)
9.1 核酸提取
9.1.1 取200μL全血或上清样品至1.5mL离心管,加入600μLTrizol溶液,振荡混匀后,室温放置
5min。
9.1.2 加200μL三氯甲烷,盖紧盖子,摇动15s,室温放置3min后,4℃12000r/min离心15min。
9.1.3 吸取上清至新的离心管,加入500μL预冷的异丙醇,上下翻转混匀,室温放置10min。
9.1.4 4℃12000r/min离心15min,缓慢弃上清,将离心管倒置于吸水纸上,将液体去除。
9.1.5 加入1000μL预冷的75%乙醇缓慢倒转洗涤沉淀。
9.1.6 4 ℃ 12000r/min离心15 min,弃上清,将离心管倒置于吸水纸上,室温干燥沉淀5 min~
10min。
9.1.7 加入40μL去离子水,4000r/min离心5s,室温溶解10min。立即使用或-70℃保存备用。
9.1.8 应设立阳性和阴性对照样品,同步进行核酸提取。以MaHV 阳性样品或含有MaHV 目的基因
的质粒作为阳性对照样品;以不含MaHV 的血清或组织样品为阴性对照样品。
9.1.9 可采用等效的商品化DNA 提取试剂盒代替以上方法。
9.2 PCR 扩增
9.2.1 反应体系
将PCR试剂、引物等室温融化,2000r/min离心5s。按样品和对照数量配置反应液,每个反应管
包含的成分见表1。
表1 PCR 反应体系配置
成分加样量终浓度
10×Taq buffer 2.5μL 1×
10mmol/LdNTPs 0.5μL 0.2mmol/L
10μmol/L 上游引物1μL 0.4mmol/L
10μmol/L 下游引物1μL 0.4mmol/L
5U/μLE×Taq 酶0.25μL 0.5U/μL
蒸馏水16.75μL —
充分混匀,向每个反应管中各分装22μL,最后加入核酸提取液3μL。
试验应设立阳性、阴性和空白对照。以MaHV 阳性样品或含有MaHV 目的基因的质粒提取的核
酸作为阳性对照;以不含MaHV 的血清或组织样品提取的核酸为阴性对照;用去离子水作为空白对照。
PCR扩增可采用等效的商品化试剂盒,并按其说明书使用。
9.2.2 反应条件
将PCR反应管瞬时离心后,置于PCR 仪,按以下程序进行扩增:95 ℃预变性10min;95 ℃变性
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SN/T5663—2024
10s,60℃退火30s,72℃ 延伸7min,共35个循环。扩增产物于4℃保存。
9.2.3 琼脂糖凝胶电泳
在产物分析区进行扩增产物电泳。制备含1.0μg/mL核酸染料的1%琼脂糖凝胶板,在电泳槽中
加入1×TAE 电泳缓冲液,使液面刚刚没过凝胶。取5μLPCR 产物,与1.0μL5×加样缓冲液混
合,加入琼脂糖凝胶板的加样孔中,同时加入DNA 分子质量标准。盖好电泳仪,插上电极,以10V/cm
恒压电泳,至溴酚蓝指示剂迁移经过凝胶约2/3长度时结束电泳。将凝胶置于凝胶成像仪下观察电泳
结果,并做好记录。
9.3 结果判定
经琼脂糖凝胶电泳后,阳性对照出现大小为249bp的特异性条带,阴性对照和空白对照无条带,则
试验成立。
待检样品电泳后出现249bp的特异性条带,则初步判定为袋鼠疱疹病毒核酸阳性,PCR产物进行
测序,将测序结果与标准参考序列(见附录C)进行比对,序列一致性达98%以上的,判定为袋鼠疱疹核
酸阳性,并可确定其基因型。
待检样品电泳无条带或条带大小不是249bp的,判定为袋鼠疱疹病毒核酸阴性。
10 实时荧光聚合酶链式反应(荧光PCR)
10.1 核酸提取
同9.1。
10.2 荧光PCR 扩增
10.2.1 反应体系
将荧光PCR试剂、引物探针等室温融化,2000r/min离心5s。按样品和对照数量配置反应液,每
个反应管包含的成分见表2。
表2 荧光PCR 反应体系配置
成分加样量终浓度
10×Taq buffer 2.5μL 1×
10mmol/LdNTPs 0.5μL 0.2mmol/L
10μmol/L 上游引物1.2μL 0.48mmol/L
10μmol/L 下游引物1.2μL 0.48mmol/L
10μmol/L 探针1.2μL 0.48mmol/L
5U/μLE×Taq 酶0.25μL 0.5U/μL
蒸馏水10.15μL —
充分混匀,向每个反应管中各分装17μL,最后加入核酸提取液3μL。
试验时应设立阳性、阴性和空白对照。以MaHV 阳性样品或含有MaHV 目的基因的质粒提取的
核酸作为阳性对照;以不含MaHV 的血清或组织样品提取的核酸作为阴性对照;用去离子水作为空白
对照。
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SN/T5663—2024
采用等效商品化试剂盒时,按其说明书使用。
10.2.2 反应条件
将PCR反应管瞬时离心后,置于荧光PCR仪,按以下程序进行扩增:
第一阶段,95℃5min;
第二阶段,95℃10s,52℃30s,45个循环,在第二阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。
10.3 结果判定
10.3.1 结果分析条件设定
综合分析仪器给出的各项结果,基线以仪器给出的默认值作为参考,阈值设定原则以阈值线刚好超
过设置的阴性对照扩增曲线的最高点为准,具体根据仪器噪声情况进行调整,选择FAM 通道进行
分析。
10.3.2 质量控制
阴性对照和空白对照无扩增曲线,且无Ct值或Ct值>40;阳性对照有典型对数增长扩增曲线,且
Ct值≤35.0。则试验成立,可进行结果判定。
10.3.3 结果描述及判定
被检样品无扩增曲线,且无Ct值或Ct值>40时,判定为袋鼠疱疹病毒核酸阴性。
被检样品出现典型的对数增长扩增曲线,且Ct值≤35时,判定为袋鼠疱疹病毒核酸阳性。
样品35<ct值≤40时,重复一次检测,若ct值≤40,且有明显的对数增长扩增曲线,判定为袋鼠
疱疹病毒核酸阳性,否则,判定为袋鼠疱疹病毒核酸阴性。
荧光PCR检测阳性的样品宜通过PCR扩增和测序以确定基因型。
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SN/T5663—2024
附 录 A
(资料性)
袋鼠疱疹病毒感染概述
袋鼠疱疹病毒感染(Macropodid herpesvirusinfection)是由袋鼠疱疹病毒(Macropodid
herpesvirus,MaHV)引起的一种导致袋鼠发热、急性呼吸道症状、泄殖腔黏膜溃疡等特征的疫病。研究
结果显示,澳大利亚约有23%的野生袋鼠和41%的圈养袋鼠血清中存在疱疹病毒中和抗体;此外,在新
西兰、美国等国家的野生和圈养袋鼠群中,疱疹病毒的感染率与澳大利亚一致。
MaHV 属于疱疹病毒科,为一种有包膜的DNA 病毒。目前,主要流行的有MaHV-1、MaHV-2和
MaHV-4三个基因型,它们均属于α 疱疹病毒亚科。帕尔马沙袋鼠、林袋鼠、短尾矮袋鼠和东部灰大袋
鼠等常见袋鼠均对不同基因型的袋鼠疱疹病毒易感。患病袋鼠常表现为精神沉郁、发热、呼吸急促、运
动失调等,严重时可引起急性死亡,部分可见结膜炎、口腔或泄殖腔黏膜溃疡等。解剖学病变主要包括
支气管炎症、肺部炎症和充血、肝脏多发性坏死灶等。病理切片可见肝脏或黏膜细胞内大量的核内包
涵体。
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SN/T5663—2024
附 录 B
(规范性)
试剂配制
B.1 灭菌生理盐水
NaCl 8.5g
蒸馏水 1000mL
溶解混匀后121℃高压灭菌15min,4℃保存。
B.2 TAE电泳缓冲液
B.2.1 0.5mol/L 乙二胺四乙酸钠(EDTA)溶液(pH8.0)
称取二水乙二胺四乙酸钠1.44g,使用80mL双蒸水充分溶解,使用氢氧化钠溶液调pH 至8.0,加
双蒸水至100mL,室温保存。
B.2.2 50×TAE电泳缓冲液
羟基甲基氨基甲烷(Tris) 242g
冰乙酸 57.1mL
0.5mol/LEDTA 溶液(pH8.0) 100mL
加双蒸水至1000mL,室温保存。
B.2.3 TAE电泳缓冲液
使用前将50×TAE电泳缓冲液做50倍稀释即可。
B.3 上样缓冲液
溴酚蓝 0.25g
蔗糖 40g
蒸馏水 100mL
溶解混匀后121℃高压灭菌15min。
B.4 1%琼脂糖凝胶
称取琼脂糖1g,使用TAE电泳缓冲液100mL充分溶解,于微波炉中完全融化,待冷却至50℃~
60℃时,加入溴化乙锭(EB)或核酸染料溶液5μL,摇匀,倒入电泳板,凝固后取下梳子,备用。
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SN/T5663—2024
附 录 C
(规范性)
参考序列
C.1 袋鼠疱疹病毒1型PCR扩增产物参考序列(GenBank:AF061754):
GGTTTCGCATGTTTGGTATGGGAGTTCCTATGCTCAACTTACTGGGTTGTTTGAGGATAG
AGCACCAATACCTTTTGCGGAAATTATGGACTTCATAAATGATAAGGGGGTGTGCAAATC
TACGGTGAAGTATACACGCCATAACCTCGAAACGACCGCTTTCCATGAAGACTCTGGCGAG
AAGGAGATGCCATTGACGCCCGCAAAAATGACGCTTAACACGGCTCGGGGGTGGAACACTG
TGGGTTT
C.2 袋鼠疱疹病毒2型PCR扩增产物参考序列(GenBank:NC043052):
TGTGGCGCATGTTTGGTATGGGTCGTCATACGCACAGATAACCGATCTGCATGAAGACAG
AGCACCGGTGCCCTTTGCTGAAATCATGGATCTCATAAACGATAAGGGGGTATGTAAATC
CTCAGTCACCTATTCACGACATAACATAGAAACCACCGCCTTCCATAAAGATTCCGGCGAA
ACAGAGATGCCGTTAATGCCTGCTAAAATGACCCTTACGACCGCTAAGGGGTGGAACACCG
TGGGGTT
C.3 袋鼠疱疹病毒4型PCR扩增产物参考序列(GenBank:JX397938):
TGTGGCGCATGTTTGGTATGGGTCGTCCTATGCACAGATAACCGATCTGTATGAAGACAG
AGCACCGGTACCCTTTGCTGAAATCATGGATCTCATAAACGATAAGGGGGTGTGCAAATC
CTCAGTCAAATATTCACGGCATAACACGGAAACTACCGCTTTTCATAAAGATTCCAGCGAA
ACAGAGATGCCGCTAATGCCCGCTAAAATGACCCTTACTACCGCTAAGGGGTGGAACACCG
TGGGGTT
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SN/T5663—2024</ct值≤40时,重复一次检测,若ct值≤40,且有明显的对数增长扩增曲线,判定为袋鼠
CCS B41
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T5663—2024
袋鼠疱疹病毒感染检疫技术规范
Quarantineprotocolformacropodidherpesvirusinfection
2024-12-31发布2025-07-01实施
中华人民共和国海关总署发布
前 言
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
请 注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位:中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国天津海关、中华人民共和国青岛海关。
本文件主要起草人:帅江冰、张晓峰、何永强、莫虹斐、曾若雪、金晨晨、陈小金、郑小龙、赵丹、张俊哲、
董志珍。
Ⅰ
SN/T5663—2024
袋鼠疱疹病毒感染检疫技术规范
1 范围
本文件规定了袋鼠疱疹病毒感染的聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光PCR检测方法的技术要求。
本文件适用于袋鼠疱疹病毒感染(见附录A)的检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T18088 出入境动物检疫采样
GB19489 实验室 生物安全通用要求
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件:
BHQ1:黑洞淬灭基团1(Blackholequencher1);
Ct:循环阈值(Cyclethreshold);
DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid);
dNTPs:三磷酸脱氧核苷酸(Deoxynucleosidetriphosphate);
FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein);
MaHV:袋鼠疱疹病毒(Macropodidherpesvirus);
PCR:聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction)。
5 实验室生物安全要求
样品处理及检测过程中所涉及的试验操作,应符合GB19489的有关规定。
6 试剂和材料
6.1 水:符合GB/T6682中一级水的要求。
6.2 灭菌生理盐水:配制方法见附录B中B.1。
6.3 Trizol裂解液。
1
SN/T5663—2024
6.4 蛋白酶K溶液(20mg/mL)。
6.5 Tris饱和酚。
6.6 三氯甲烷。
6.7 异丙醇。
6.8 无水乙醇。
6.9 E×Taq 酶。
6.10 10× PCR缓冲液。
6.11 dNTPs(含dCTP、dGTP、dATP、dTTP)。
6.12 琼脂糖。
6.13 DNA 分子质量标准。
6.14 TAE电泳缓冲液:配制方法见B.2。
6.15 上样缓冲液:配制方法见B.3。
6.16 质控物质:阳性质控品为含MaHV 目的基因的质粒(序列参考信息见附录C);阴性质控品为不
含MaHV 的组织或血清。
6.17 PCR引物序列:
上游引物UL27-F2.3:5'-TGTTTCGCATGTTTGGTATG-3';
下游引物UL27-R2.3:5'-AAMCCCACAGTGTTCCACCC-3'。
引物用ddH2O 溶解至10μmol/L后,保存于-20℃备用。
6.18 荧光PCR引物和探针序列:
上游引物UL27-F1:5'-GGGAYTGGGTTCCCAAGAA-3';
下游引物UL27-R1:5'-TGGTMGTGAAGGTGGTRGATA-3';
探针序列UL27-probe:FAM-TGGCAAGAAGTCGATGAGATGCTCCG-BHQ1。
引物和探针分别用ddH2O 溶解至10μmol/L后,保存于-20℃备用。
7 仪器和设备
7.1 Ⅱ级生物安全柜
7.2 PCR仪。
7.3 荧光定量PCR仪。
7.4 分析天平(感量0.001g)。
7.5 漩涡振荡器。
7.6 台式冷冻离心机。
7.7 微量可调移液器:0.1μL~2.5μL、2μL~20μL、20μL~200μL、100μL~1000μL。
7.8 电泳仪。
7.9 凝胶成像系统。
8 样品采集与制备
8.1 根据GB/T18088确定采样动物数量。
8.2 鼻拭子:将棉拭子深入鼻腔深处,轻轻旋转拭子3圈~5圈,然后慢慢取出,将拭子放入盛有灭菌生
理盐水的采样管中。
8.3 血液样品:采用含有抗凝剂的真空采血管无菌采集袋鼠血液样品,4℃保存备用。
8.4 粪便或泄殖腔拭子:采集新鲜粪便样品,加入等体积灭菌生理盐水,振荡;将拭子深入泄殖腔转一
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圈并蘸取少量粪便,放入盛有2mL灭菌生理盐水的采样管中。3000r/min4 ℃离心10min,取上清
备用。
8.5 组织样品:无菌采集临床发病袋鼠的主要靶器官,称重1g加入适量灭菌生理盐水研磨匀浆,制成
20%悬液(质量浓度),冻融2次~3次,4000r/min4℃离心10min,取上清备用。
9 聚合酶链式反应(PCR)
9.1 核酸提取
9.1.1 取200μL全血或上清样品至1.5mL离心管,加入600μLTrizol溶液,振荡混匀后,室温放置
5min。
9.1.2 加200μL三氯甲烷,盖紧盖子,摇动15s,室温放置3min后,4℃12000r/min离心15min。
9.1.3 吸取上清至新的离心管,加入500μL预冷的异丙醇,上下翻转混匀,室温放置10min。
9.1.4 4℃12000r/min离心15min,缓慢弃上清,将离心管倒置于吸水纸上,将液体去除。
9.1.5 加入1000μL预冷的75%乙醇缓慢倒转洗涤沉淀。
9.1.6 4 ℃ 12000r/min离心15 min,弃上清,将离心管倒置于吸水纸上,室温干燥沉淀5 min~
10min。
9.1.7 加入40μL去离子水,4000r/min离心5s,室温溶解10min。立即使用或-70℃保存备用。
9.1.8 应设立阳性和阴性对照样品,同步进行核酸提取。以MaHV 阳性样品或含有MaHV 目的基因
的质粒作为阳性对照样品;以不含MaHV 的血清或组织样品为阴性对照样品。
9.1.9 可采用等效的商品化DNA 提取试剂盒代替以上方法。
9.2 PCR 扩增
9.2.1 反应体系
将PCR试剂、引物等室温融化,2000r/min离心5s。按样品和对照数量配置反应液,每个反应管
包含的成分见表1。
表1 PCR 反应体系配置
成分加样量终浓度
10×Taq buffer 2.5μL 1×
10mmol/LdNTPs 0.5μL 0.2mmol/L
10μmol/L 上游引物1μL 0.4mmol/L
10μmol/L 下游引物1μL 0.4mmol/L
5U/μLE×Taq 酶0.25μL 0.5U/μL
蒸馏水16.75μL —
充分混匀,向每个反应管中各分装22μL,最后加入核酸提取液3μL。
试验应设立阳性、阴性和空白对照。以MaHV 阳性样品或含有MaHV 目的基因的质粒提取的核
酸作为阳性对照;以不含MaHV 的血清或组织样品提取的核酸为阴性对照;用去离子水作为空白对照。
PCR扩增可采用等效的商品化试剂盒,并按其说明书使用。
9.2.2 反应条件
将PCR反应管瞬时离心后,置于PCR 仪,按以下程序进行扩增:95 ℃预变性10min;95 ℃变性
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SN/T5663—2024
10s,60℃退火30s,72℃ 延伸7min,共35个循环。扩增产物于4℃保存。
9.2.3 琼脂糖凝胶电泳
在产物分析区进行扩增产物电泳。制备含1.0μg/mL核酸染料的1%琼脂糖凝胶板,在电泳槽中
加入1×TAE 电泳缓冲液,使液面刚刚没过凝胶。取5μLPCR 产物,与1.0μL5×加样缓冲液混
合,加入琼脂糖凝胶板的加样孔中,同时加入DNA 分子质量标准。盖好电泳仪,插上电极,以10V/cm
恒压电泳,至溴酚蓝指示剂迁移经过凝胶约2/3长度时结束电泳。将凝胶置于凝胶成像仪下观察电泳
结果,并做好记录。
9.3 结果判定
经琼脂糖凝胶电泳后,阳性对照出现大小为249bp的特异性条带,阴性对照和空白对照无条带,则
试验成立。
待检样品电泳后出现249bp的特异性条带,则初步判定为袋鼠疱疹病毒核酸阳性,PCR产物进行
测序,将测序结果与标准参考序列(见附录C)进行比对,序列一致性达98%以上的,判定为袋鼠疱疹核
酸阳性,并可确定其基因型。
待检样品电泳无条带或条带大小不是249bp的,判定为袋鼠疱疹病毒核酸阴性。
10 实时荧光聚合酶链式反应(荧光PCR)
10.1 核酸提取
同9.1。
10.2 荧光PCR 扩增
10.2.1 反应体系
将荧光PCR试剂、引物探针等室温融化,2000r/min离心5s。按样品和对照数量配置反应液,每
个反应管包含的成分见表2。
表2 荧光PCR 反应体系配置
成分加样量终浓度
10×Taq buffer 2.5μL 1×
10mmol/LdNTPs 0.5μL 0.2mmol/L
10μmol/L 上游引物1.2μL 0.48mmol/L
10μmol/L 下游引物1.2μL 0.48mmol/L
10μmol/L 探针1.2μL 0.48mmol/L
5U/μLE×Taq 酶0.25μL 0.5U/μL
蒸馏水10.15μL —
充分混匀,向每个反应管中各分装17μL,最后加入核酸提取液3μL。
试验时应设立阳性、阴性和空白对照。以MaHV 阳性样品或含有MaHV 目的基因的质粒提取的
核酸作为阳性对照;以不含MaHV 的血清或组织样品提取的核酸作为阴性对照;用去离子水作为空白
对照。
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采用等效商品化试剂盒时,按其说明书使用。
10.2.2 反应条件
将PCR反应管瞬时离心后,置于荧光PCR仪,按以下程序进行扩增:
第一阶段,95℃5min;
第二阶段,95℃10s,52℃30s,45个循环,在第二阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。
10.3 结果判定
10.3.1 结果分析条件设定
综合分析仪器给出的各项结果,基线以仪器给出的默认值作为参考,阈值设定原则以阈值线刚好超
过设置的阴性对照扩增曲线的最高点为准,具体根据仪器噪声情况进行调整,选择FAM 通道进行
分析。
10.3.2 质量控制
阴性对照和空白对照无扩增曲线,且无Ct值或Ct值>40;阳性对照有典型对数增长扩增曲线,且
Ct值≤35.0。则试验成立,可进行结果判定。
10.3.3 结果描述及判定
被检样品无扩增曲线,且无Ct值或Ct值>40时,判定为袋鼠疱疹病毒核酸阴性。
被检样品出现典型的对数增长扩增曲线,且Ct值≤35时,判定为袋鼠疱疹病毒核酸阳性。
样品35<ct值≤40时,重复一次检测,若ct值≤40,且有明显的对数增长扩增曲线,判定为袋鼠
疱疹病毒核酸阳性,否则,判定为袋鼠疱疹病毒核酸阴性。
荧光PCR检测阳性的样品宜通过PCR扩增和测序以确定基因型。
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附 录 A
(资料性)
袋鼠疱疹病毒感染概述
袋鼠疱疹病毒感染(Macropodid herpesvirusinfection)是由袋鼠疱疹病毒(Macropodid
herpesvirus,MaHV)引起的一种导致袋鼠发热、急性呼吸道症状、泄殖腔黏膜溃疡等特征的疫病。研究
结果显示,澳大利亚约有23%的野生袋鼠和41%的圈养袋鼠血清中存在疱疹病毒中和抗体;此外,在新
西兰、美国等国家的野生和圈养袋鼠群中,疱疹病毒的感染率与澳大利亚一致。
MaHV 属于疱疹病毒科,为一种有包膜的DNA 病毒。目前,主要流行的有MaHV-1、MaHV-2和
MaHV-4三个基因型,它们均属于α 疱疹病毒亚科。帕尔马沙袋鼠、林袋鼠、短尾矮袋鼠和东部灰大袋
鼠等常见袋鼠均对不同基因型的袋鼠疱疹病毒易感。患病袋鼠常表现为精神沉郁、发热、呼吸急促、运
动失调等,严重时可引起急性死亡,部分可见结膜炎、口腔或泄殖腔黏膜溃疡等。解剖学病变主要包括
支气管炎症、肺部炎症和充血、肝脏多发性坏死灶等。病理切片可见肝脏或黏膜细胞内大量的核内包
涵体。
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附 录 B
(规范性)
试剂配制
B.1 灭菌生理盐水
NaCl 8.5g
蒸馏水 1000mL
溶解混匀后121℃高压灭菌15min,4℃保存。
B.2 TAE电泳缓冲液
B.2.1 0.5mol/L 乙二胺四乙酸钠(EDTA)溶液(pH8.0)
称取二水乙二胺四乙酸钠1.44g,使用80mL双蒸水充分溶解,使用氢氧化钠溶液调pH 至8.0,加
双蒸水至100mL,室温保存。
B.2.2 50×TAE电泳缓冲液
羟基甲基氨基甲烷(Tris) 242g
冰乙酸 57.1mL
0.5mol/LEDTA 溶液(pH8.0) 100mL
加双蒸水至1000mL,室温保存。
B.2.3 TAE电泳缓冲液
使用前将50×TAE电泳缓冲液做50倍稀释即可。
B.3 上样缓冲液
溴酚蓝 0.25g
蔗糖 40g
蒸馏水 100mL
溶解混匀后121℃高压灭菌15min。
B.4 1%琼脂糖凝胶
称取琼脂糖1g,使用TAE电泳缓冲液100mL充分溶解,于微波炉中完全融化,待冷却至50℃~
60℃时,加入溴化乙锭(EB)或核酸染料溶液5μL,摇匀,倒入电泳板,凝固后取下梳子,备用。
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附 录 C
(规范性)
参考序列
C.1 袋鼠疱疹病毒1型PCR扩增产物参考序列(GenBank:AF061754):
GGTTTCGCATGTTTGGTATGGGAGTTCCTATGCTCAACTTACTGGGTTGTTTGAGGATAG
AGCACCAATACCTTTTGCGGAAATTATGGACTTCATAAATGATAAGGGGGTGTGCAAATC
TACGGTGAAGTATACACGCCATAACCTCGAAACGACCGCTTTCCATGAAGACTCTGGCGAG
AAGGAGATGCCATTGACGCCCGCAAAAATGACGCTTAACACGGCTCGGGGGTGGAACACTG
TGGGTTT
C.2 袋鼠疱疹病毒2型PCR扩增产物参考序列(GenBank:NC043052):
TGTGGCGCATGTTTGGTATGGGTCGTCATACGCACAGATAACCGATCTGCATGAAGACAG
AGCACCGGTGCCCTTTGCTGAAATCATGGATCTCATAAACGATAAGGGGGTATGTAAATC
CTCAGTCACCTATTCACGACATAACATAGAAACCACCGCCTTCCATAAAGATTCCGGCGAA
ACAGAGATGCCGTTAATGCCTGCTAAAATGACCCTTACGACCGCTAAGGGGTGGAACACCG
TGGGGTT
C.3 袋鼠疱疹病毒4型PCR扩增产物参考序列(GenBank:JX397938):
TGTGGCGCATGTTTGGTATGGGTCGTCCTATGCACAGATAACCGATCTGTATGAAGACAG
AGCACCGGTACCCTTTGCTGAAATCATGGATCTCATAAACGATAAGGGGGTGTGCAAATC
CTCAGTCAAATATTCACGGCATAACACGGAAACTACCGCTTTTCATAAAGATTCCAGCGAA
ACAGAGATGCCGCTAATGCCCGCTAAAATGACCCTTACTACCGCTAAGGGGTGGAACACCG
TGGGGTT
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SN/T5663—2024</ct值≤40时,重复一次检测,若ct值≤40,且有明显的对数增长扩增曲线,判定为袋鼠
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