十二直肠贾第虫 PCR 检测方法
1 范围
本文件规定了十二指肠贾第虫PCR检测方法的材料、操作步骤和结果判定。
本文件适用于动物粪便样品中十二指肠贾第虫核酸的检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
GB/T 27401 实验室质量控制规范 兽医学检测
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BSL：生物安全防护实验室(biosafety laboratory)
bp：碱基对(base pair)
ddH2O：双蒸水(double-distilled H2O)
DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)
GDH：谷氨酸脱氢酶(Glutamate Dehydrogenase)
PCR：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)
TAE Tris：三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸缓冲液(Trisaectate-EDTA Buffer)
rTaq酶：rTaq DNA聚合酶(rTaq DNA polymerase)
5 主要仪器与设备
5.1 PCR 扩增仪。
5.2 漩涡振荡器。
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5.3 台式离心机。
5.4 微量可调移液器及配套吸头(1 μL ~ 2.5 μL，0.5 μL ~ 10 μL，10 μL ~ 100 μL，100 μL ~ 1000 μL)。
5.5 核酸电泳仪。
5.6 核酸电泳槽。
5.7 凝胶成像分析系统。
5.8 高压蒸汽灭菌器。
5.9 生物安全柜或超净台。
6 试剂与耗材
6.1 一次性密封袋。
6.2 EP 离心管(1.5 mL)。
6.3 2.5 %重铬酸钾溶液，按照附录A.1 规定的方法配制。
6.4 粪便基因组 DNA 提取试剂盒(市售产品，可选择同类产品替代)。
6.5 PCR 管(200 μL)。
6.6 PCR 扩增试剂盒(市售产品，可选择同类产品替代)。
6.7 1× TAE 缓冲液，按照附录 A.2 和附录A.3 规定的方法配制。
6.8 安全无毒核酸染料。
6.9 配置试剂用水采用蒸馏水或去离子水，PCR 用水按照 GB/T 6682 中一级水的规定执行。
6.10 巢式 PCR 引物。参照十二指肠贾第虫 GDH 基因位点参考序列(见附录 B)，设计巢氏 PCR 扩增特异性引物序列，见附录 C 中表 C.1。
6.11 DNA 标准分子质量。
6.12 1 %琼脂糖凝胶，按照附录 A.4 规定的方法配制。
6.13 阳性对照：已经鉴定的十二指肠贾第虫 DNA 样品。
6.14 阴性对照：灭菌双蒸水。
7 样品的采集、保存及运送
7.1 样品的采集
应按照 GB/T 27401 的相关要求进行采样。具有掌握相关专业知识和操作技能的工作人员操作，小动物(如兔、小型啮齿类等)采用无菌棉拭子直肠取样，置入密封袋;中大型家畜(如牛、羊、猪等)：一次性手套取 10g 新鲜粪便(或拭子采集)，置入密封袋。整个采样过程，应佩戴一次性手套，避免交叉污染。每份样本应标记编号、动物种类、年龄、品种、采样时间、采集地点等信息。
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7.2 样本的保存与运输
采集的新鲜粪便样品，在2 ℃ ~ 8 ℃的条件下保存应不超过24 h，长期保存需置于2.5 %重铬酸钾溶液中。
长距离运输的样品应先置于密封不透水、防泄漏容器内，再将容器放入具有防压、不透水及防泄漏功能的辅助包装中，最后在周围放置医用冰袋或冷冻制剂，以确保样本维持低温状态。样本应尽快送达检测实验室，最迟不超过72h。
7.3 样本处理的生物安全要求
应按照GB 19489的相关要求，在生物安全2级(BSL-2)实验室中进行检测工作，检测后的样品的处理应按照GB/T 27401中有关规定进行处理。
8 操作方法
8.1 DNA 制备
8.1.1 按商业化粪便基因组 DNA 提取试剂盒推荐的操作方法进行，确保提取的 DNA 质量与纯度。
8.1.2 提取的 DNA 样品，应在 30 min 内进行 PCR 扩增或在-20 ℃环境下长期保存。
8.2 PCR 检测
8.2.1 巢氏 PCR 反应体系与扩增程序
8.2.1.1 第一轮 PCR 反应体系与扩增程序
以提取的 DNA 为模板，将所有试剂、引物加入 PCR 反应管，反应体系的配置见附录 D 中表 D.1。第一轮 PCR 扩增反应的反应程序见附录D.2。
8.2.1.2 第二轮 PCR 反应体系与扩增程序
以第一轮扩增产物为模板，将所有试剂、引物加入 PCR 反应管，反应体系的配置见附录 D 中表
D.3 。配置完反应液后应充分震荡混匀并离心之后，进行第二轮扩增。
第二轮 PCR 扩增反应的反应程序见附录D.4。
8.3 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳及成像
使用 1× TAE 缓冲溶液配制 1.0 %琼脂糖凝胶，取第二轮 PCR 扩增产物 5 µL ~ 10 µL ，置于 1.0 %琼脂糖凝胶中进行电泳，120 V 电压电泳约30 min，经凝胶成像分析系统成像并观察结果。
9 结果判定
9.1 试验成立条件判定
十二指肠贾第虫阳性对照在 530 bp 处，出现相应的特异性条带，阴性对照无扩增条带(见附录 E中图 E.1)，判定为试验成立。
9.2 结果描述及判定
9.2.1 阳性
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试验成立条件下，被检样品在 530 bp 处出现特异性条带，判定为十二指肠贾第虫核酸阳性。如果需要进一步鉴定其序列或基因型，可对 PCR 扩增产物进行测序。
9.2.2 阴性
试验成立条件下，被检样品在 530 bp 处无特异性扩增条带，判定为十二指肠贾第虫核酸阴性。
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附 录 A
(规范性)
试剂配制方法
A.1 2.5 % 重铬酸钾溶液
称取2.5 g 重铬酸钾，加灭菌蒸馏水溶解，定容至100 mL ，保存于室温。
A.2 50× TAE缓冲液
用800 mL灭菌去离子水溶解，充分混匀后用灭菌去离子水补齐至1000 mL，在1.034×105Pa高压下蒸汽灭菌30 min，保存于室温备用。
A.3 1 × TAE使用液
50×TAE贮存液 10 mL
去离子水 490 mL
混匀，常温保存备用。
A.4 1.0 %的琼脂糖凝胶
称取1.0 g琼脂糖粉，放入干净的三角瓶中。加入100 mL的1×TAE缓冲液。摇匀后，将三角瓶放入微波炉中高火加热，使琼脂糖粉完全溶解。加热过程中需要间断取出摇匀，以防溶液暴沸。溶液冷却至60 ℃左右(不烫手但仍温热)时，按体积比1:10,000加入安全无毒核酸染料之后，将其倒入已放置好梳子的制胶模具中。待凝胶完全凝固(约30 min ~ 60 min)后，将梳子轻轻拔出，即可放入电泳槽中使用。
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附 录 B
(资料性)
十二指肠贾第虫 GDH 基因位点片段基因序列
B.1 十二指肠贾第虫GDH基因位点片段参考序列(GenBank Accession No. EU637585.1)
5´-ATGACCGAGCTCCAGAGGCACGTCGGGGCTGACACCGACGTTCCTGCTGGCGATATTGG CGTCGGCGGTCGCGAGATCGGTTATCTGTTTGGACAGTATAAGCGCCTCAGGAACGAGTTTACGGG CGTCCTCACGGGCAAGAACATCAAGTGGGGCGGGTCTCTCATCAGACCAGAGGCCACAGGGTATG GAGCTGTCTACTTCCTGGAGGAGATGTGCAAGGATAACAACACCGTAATCAGGGGCAAGAACGTC CTCCTCTCTGGCTCTGGCAACGTTGCTCAGTACGCGTGCGAGAAGCTCCTCCAGCTCGGTGCGAA GGTCCTCACCTTCTCGGACTCCAACGGGACTGTCGTCGATAAGGATGGCTTCAACGAGGAGAAGC TGGCCCACCTCATGCACCTCAAGAATGAGAAGCGCGGGCGCATCGCTGAGTTCAAGGAGAAGTAT CCCAGCGTCGTGTATCACGAGAACAAGAAACCCTGGGAGTGCTTCGACGGGCAGGTGGATTGCA TCATGCCCTGCGCCAC-3´
注：粗体为引物序列。
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附 录 C
(资料性)
十二指肠贾第虫巢氏 PCR 扩增特异性引物序列
毕氏肠微孢子虫巢氏PCR的引物的名称与序列见表C.1。
表C.1 毕氏肠微孢子虫巢氏PCR引物序列
注1：R代表A/G碱基，Y代表C/T碱基。
注2：上下游内引物和外引物工作浓度均为25 μM。
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附 录 D
(资料性)
巢氏 PCR 反应
D.1 第一轮PCR反应体系
第一轮 PCR 扩增反应体系见表D.1。
表D.1 第一轮PCR扩增反应体系(25 μL)
D.2 第一轮PCR反应程序
第一轮 PCR 扩增反应程序见表 D.2。
表D.2 第一轮PCR扩增反应程序
D.3 第二轮PCR反应体系
第二轮 PCR 扩增反应体系见表 D.3。
表D.3 第二轮PCR扩增反应体系(25 μL)
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D.4 第二轮PCR反应程序
第二轮 PCR 扩增反应程序见表 D.4。
表D.4 第二轮PCR扩增反应程序
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附 录 E
(资料性)
十二指肠贾第虫 GDH 基因位点 PCR 扩增产物电泳结果示意图
十二指肠贾第虫 GDH 基因位点 PCR 扩增产物电泳结果示意图见图E.1。
标引序号说明：
M —— DNA Marker;
1-3 —— 被检样品;
P —— 阳性对照;
N —— 阴性对照。
图E.1 十二指肠贾第虫GDH基因位点PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳示意图
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