本文件规定了嗜吞噬细胞无浆体、牛无浆体、绵羊无浆体、山羊无浆体四种羊无浆体检测的巢式PCR 扩增要求，描述了相应的样品制备方法和结果判定的要求。
本文件适用于羊无浆体病的病原检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
GB/T 27401 实验室质量控制规范 兽医学检测
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
无浆体 Anaplasma
无浆体(Anaplasma)也称无形体，主要包括的种类有：绵羊无浆体(A. ovis)、山羊无浆体(A. capra)、牛无浆体(A. bovis)、嗜吞噬细胞无浆体(A. phagocytophilum)、中央无浆体(A. centrale)、边缘无浆体(A. marginale)等。我国可以感染羊的无浆体有绵羊无浆体、山羊无浆体、牛无浆体和嗜吞噬细胞无浆体4种。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid)
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸(Deoxyribonucleoside Triphosphate)
PCR：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)
PBS：磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline)
TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液(Tris-Acetate-EDTA Buffer)
5 试剂、耗材和设备
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5.1 试剂
5.1.1 除非另有说明，检测中所用试剂均为分析纯，试验用水符合 GB/T 6682 的要求。
5.1.2 血液基因组 DNA 提取试剂盒。
5.1.3 PCR 扩增试剂盒。
5.1.4 r Taq 酶。
5.1.5 Loading Buffer。
5.1.6 1×TAE ，见附录 A 中 A.1。
5.1.7 1.0%琼脂糖(电泳级)，见附录A.2。
5.1.8 DNA GREEN 核酸染料。
5.1.9 巢式 PCR 引物。分别参照嗜吞噬细胞无浆体 rrs 基因、牛无浆体 AB1 基因、绵羊无浆体 Msp4基因、山羊无浆体 glta 基因位点片段参考序列(见附录 B 中 B.1、B.2 、B.3 、B.4)，设计嗜吞噬细胞无浆体、牛无浆体、绵羊无浆体、山羊无浆体巢氏 PCR 扩增特异性引物序列，见附录 C。
5.1.10 DNA 标准分子量。
5.1.11 阳性对照：已经鉴定的嗜吞噬细胞无浆体、牛无浆体、绵羊无浆体和山羊无浆体 DNA 样品。
5.1.12 阴性对照：灭菌双蒸水。
5.2 耗材
5.2.1 1.5 mL 离心管、2 mL 离心管。
5.2.2 100 mL 量筒、1000 mL 量筒。
5.2.3 1000 mL 烧杯。
5.2.4 PE 手套。
5.2.5 抗凝采血管。
5.2.6 150 μL PCR 管。
5.2.7 不同规格的移液器和适配的枪头。
5.3 设备
5.3.1 冰箱。
5.3.2 自动平衡离心机。
5.3.3 恒温水浴锅。
5.3.4 PCR 扩增仪。
5.3.5 核酸电泳系统。
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5.3.6 凝胶成像仪。
6 生物安全要求
6.1 样品的采集
应按照 GB/T 27401 的相关要求进行采样。具有掌握相关专业知识和操作技能的工作人员操作，对待检测羊逐只进行颈静脉无菌采血，使用抗凝采血管收集血液样本，置于 4 ℃冰箱保存待用。
6.2 样本处理的生物安全要求
应按照GB 19489的相关要求，在生物安全1级(BSL-1)及以上实验室中进行检测工作，检测后的样品的处理应按照GB/T 27401中有关规定进行处理。
7 PCR扩增鉴定
7.1 DNA 提取
基因组DNA的提取按照市售的血液基因组提取试剂盒说明书进行操作。
7.2 反应体系及条件
7.2.1 无浆体巢氏 PCR 反应体系与扩增程序
7.2.1.1 嗜吞噬细胞无浆体巢氏 PCR 反应体系与扩增程序
嗜吞噬细胞无浆体第一轮 PCR 扩增反应以提取的 DNA 为模板，将所有试剂、引物加入 PCR 反应管，第一轮 PCR 反应体系的配置见附录 D 中表 D.1，第一轮扩增程序见附录D.3。
第二轮 PCR 扩增反应以第一轮扩增产物为模板，将所有试剂、引物加入 PCR 反应管，第二轮 PCR反应体系的配置见附录 D.2，第二轮扩增程序见附录 D.3。
7.2.1.2 牛无浆体巢氏 PCR 反应体系与扩增程序
牛无浆体第一轮 PCR 扩增反应以提取的 DNA 为模板，将所有试剂、引物加入 PCR 反应管，第一轮 PCR 反应体系的配置见附录 D.1，第一轮扩增程序见附录D.4。
第二轮 PCR 扩增反应以第一轮扩增产物为模板，第二轮 PCR 反应体系的配置见附录 D.2，第二轮扩增程序见附录 D.4。
7.2.1.3 绵羊无浆体巢氏 PCR 反应体系与扩增程序
绵羊无浆体第一轮 PCR 扩增反应以提取的 DNA 为模板，将所有试剂、引物加入 PCR 反应管，第一轮 PCR 反应体系的配置见附录 D.1，第一轮扩增程序见附录D.5。
第二轮 PCR 扩增反应以第一轮扩增产物为模板，第二轮 PCR 反应体系的配置见附录 D.2，第二轮扩增程序见附录 D.5。
7.2.1.4 山羊无浆体巢氏 PCR 反应体系与扩增程序
山羊无浆体第一轮 PCR 扩增反应以提取的 DNA 为模板，将所有试剂、引物加入 PCR 反应管，第一轮 PCR 反应体系的配置见附录 D.1，第一轮扩增程序见附录D.6。
第二轮 PCR 扩增反应以第一轮扩增产物为模板，第二轮 PCR 反应体系的配置见附录 D.2，第二轮扩增程序见附录 D.6。
7.3 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳及成像
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使用 1× TAE 缓冲溶液配制 1.0 %琼脂糖凝胶，取 5 µL 第二轮 PCR 扩增产物与 1 μL 6×Loading Buffer 混匀，置于 1.0 %琼脂糖凝胶中进行电泳，100 V 电压电泳约 25 min，经凝胶成像分析系统成像并观察结果。
8 结果判定
8.1 试验成立条件
嗜吞噬细胞无浆体、牛无浆体、绵羊无浆体和山羊无浆体的阳性对照样品分别扩出 641 bp、551 bp、 584 bp、594 bp 大小的特异性条带，标准阴性对照无扩增条带时，判为实验有效。
8.2 阳性
8.2.1 待检样品在嗜吞噬细胞无浆体检测体系中扩增出 641bp 大小的条带，可判定为嗜吞噬细胞无浆体核酸阳性。
8.2.2 待检样品在牛无浆体检测体系中扩增出 551bp 大小的条带，可判定为牛无浆体核酸阳性。
8.2.3 待检样品在绵羊无浆体检测体系中扩增出 584bp 大小的条带，可判定为绵羊无浆体核酸阳性。
8.2.4 待检样品在山羊无浆体检测体系中扩增出 594bp 大小的条带，可判定为山羊无浆体核酸阳性。
8.3 阴性
8.3.1 待检样品在嗜吞噬细胞无浆体检测体系中未扩增出 641bp 大小的条带，重复提取 PCR 并再独立进行 1 次巢式 PCR 检测后仍未出现扩增条带时，可判定为嗜吞噬细胞无浆体核酸阴性。
8.3.2 待检样品在牛无浆体检测体系中未扩增出 551bp 大小的条带，重复提取 PCR 并再独立进行 1 次巢式 PCR 检测后仍未出现扩增条带时，可判定为牛无浆体核酸阴性。
8.3.3 待检样品在绵羊无浆体检测体系中未扩增出 584bp 大小的条带，重复提取 PCR 并再独立进行 1次巢式 PCR 检测后仍未出现扩增条带时。
8.3.4 待检样品在山羊无浆体检测体系中未扩增出 594bp 大小的条带，重复提取 PCR 并再独立进行 1次巢式 PCR 检测后仍未出现扩增条带时，可判定为山羊无浆体核酸阴性。
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附 录 A (规范性)溶液配置
A.1 电泳缓冲液(TAE)的配制
A.1.1 50 × TAE 贮存液
用800 mL灭菌去离子水溶解，充分混匀后用灭菌去离子水补齐至1000 mL ，常温保存备用。
A.1.2 1 × TAE 使用液
称取1.0 g琼脂糖粉，放入干净的三角瓶中。加入100 mL的1×TAE缓冲液。摇匀后，将三角瓶放入微波炉中高火加热，使琼脂糖粉完全溶解。加热过程中需要间断取出摇匀，以防溶液暴沸。溶液冷却至60 ℃左右(不烫手但仍温热)时，按体积比1:10,000加入安全无毒核酸染料之后，将其倒入已放置好梳子的制胶模具中。待凝胶完全凝固(约30 min ~ 60 min)后，将梳子轻轻拔出，即可放入电泳槽中使用。
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附 录 B
(资料性)
四种无浆体特异性基因片段序列
B.1 嗜吞噬细胞无浆体rrs基因位点片段参考序列(GenBank Accession No. OQ909490.1)
5,-GAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAAGCTTAACACATGCAAGTCGAA CGGATTGTCTTTGTAGCTTGCTACGAAGATAATTAGTGGCAGACGGGTGAGTAATGCATAGGAAT CTACCTAGTAGTATAGGATAGCCACTAGAAATGGTGGGTAATACTGTATAATCCCTGCGGGGGA AAGATTTATCGCTACATGATGAGCCTATGTTAGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAAGGCCTACCAA GGCGATGATCTATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGATACGGTCCAGA CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCTATGCCG CGTGAGTGAGGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAACTCTTTCAGTGGGGAAGATAATGACGGTACCCA CAGAAGAAGTCCCGGCAAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCAAGCGTTGTT CGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCATGTAGGCGGTTCGGTAAGTTAAAGGTGAAATGCCAGGGCT TAACCCTGGAGCTGCTTTTAATACTGCCAGACTCGAGTCCGGAAGAGGATAGCGGAATTCCTAGT GTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTAGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTATCTGGTCCGGT ACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG TAAACGATGAGTGCTGAATGTGGGGATAATTTATCTCCGTGTTGTAGCTAACGCGTTAAGCACT CCGCCTGGGGACTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGG TGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCACTCCTTGACATGGAGATTAGA TCCTTCTTAACGGAAGGGCGCAGTTCGGCTGGATCTCGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGC TCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGTAACCCTCATCCTTAGTTGCCAGCGG GTAAGCCGGGCACTTTAAGGAAACTGCCGGTGGTAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGATGTCAAG TCAGCACGGCCCTTATGGGGTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGACTACAATAGGTTGCAATG TCGCAAGGCTGAGCTAATCCGTAAAAGTCATCTCAGTTCGGATTGTCCTCTGCAACTCGAGGGCA TGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTA CACACTGCCCGTCACGCCATGGGAATTGGCTTAACTCGAAGCTGGTGCGCTAACCGAAAGGAAG CAGCCATTTAAGGTTGGGTCAGTGACTAGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACT-3,
注：下划线加粗部分为第一轮引物序列，粗体灰色部分为第二轮引物的引物序列;粗体灰色下划线为下游引物的重叠序列。下游引物均为列出序列的反向互补序列。
B.2 牛无浆体AB1 基因位点片段参考序列(GenBank Accession No. MH255940.1)
5,-TTTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAAGCTTAACACATGCAAGT CGAACGGATTGTTCTCGTAGCTTGCTATGAGAACAATTAGTGGCAGACGGGTGAGTAATGCATAGG AATCTACCTAGTAGTATAGGATAGCCACTAGAAATGGTGGGTAATACTGTATAATCCCTGCGGGGGA AAGATTTATCGCTACATGATGAGCCTATGTTAGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGG CAGTGATCTATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTC CTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCTATGCCGCGTG AGTGAGGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAACTCTTTCAGTGGGGAAGATAATGACGGTACCCACAGAA
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GAAGTCCCGGCAAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCAAGCGTTGTTCGGAAT TATTGGGCGTAAAGGGCATGTAGGTGGTTTGGTAAGTTAAAGGTGAAATGCCAGGGCTTAACCCTG GAGCTGCTTTTAATACTGCCAGACTGGAGTCCGGGAGA GGATAGCGGAATTCCTAGTGTAGAGGTG AAATTCGTAGATATTAGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTATCTGGTCCGGTACTGACACTGA GGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGAGT GCTGGATGTGGGGGTTTTTACCTCCGTGTTGTAGCTAACGCGTTAAGCACTCCGCCTGGGGACTAC GGTCGCAAGACTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTT AATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCACTCCTTGACATGAAGATTAGATCCTCCTTAACAGGAG GGCGCAGTTAGGCTGGGTCTTGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT GGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGTAACCCTCACCCTTAGTTGCCAGCGGGTAATGCCGGGGACTTTA AGGGAACTGCCAGTGGTAAGCTGGAGGAAGGTGGGGATGATGTCAAGTCAGCATGGCCCTTATGG GGTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGACTACAATAGGTTGCAATGCCGTAAGGCTGAGCTAATC CGTCAAAAGTCATCTTAGTTCGGATTGTCCTCTGCAACTCGAGGGCATGAAGCAGGAATCGCTAGT AATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACACTGCCCGTCACGCCAT GGGAATTGGCTTAACTCGAAGCTGGTGCGCCAACCGAAAGGAGGCAGCCATTTAAGGTTGGGT CAGTGACTAGGGTGAA-3,
注：下划线加粗部分为第一轮引物序列，加粗倾斜灰色部分为第二轮引物的引物序列;下游引物均为列出序列的反向互补序列。
B.3 绵羊无浆体Msp4 基因位点片段参考序列(GenBank Accession No. LC141077.1)
5,-GGGAGCTCCTATGAATTACAGAGAATTGTTTACAGGGGGCCTGTCAGCAGCCACAGTCTGC GCCTGCTCCCTACTTGTTAGTGGGGCCGTAGTGGCGTCTCCCATGAGTCATGAAGTGGCTTCTGA AGGGAGCGGGGTCATGGGAGGTAGCTTTTATGTGAGTGCGGCTTACAGCCCAGCGTTTCCCTCTGT TACCTCATTCGACATGCGTGAGT CAAGCAGAGAGACCTCGTATGTTAGAGGCTATGACAAGAGTGT TGCAACAATTGATGTGAGTGCGCCAGCAAACTTTTCCAAATCCGGCTACACTTTTGCTTTCTCTAA GAATTTACTCACATCTTTCGACGGCGCTGTGGGATATTCTCTGGGAGGAGCTAGAGTGGAACTAGA AGCAAGCTACAGAAGGTTTGCTACTTTAGCGGACGGGCAGTACGCAAAAAGTGGTGCAGAGTCCC TGGCTGCAATTACTCGCGACGCTGCCATTACTGAGAACAATTACTTTGTGGTCAAAATCGATGAAA TCACAAACACTTCAGTCATGCTAAATGGCTGCTATGACGTGTTGCACACAGATTTGCCTGTGTCCC CATATGTGTGTGCCGGAATAGGTGCTAGCTTTGTCGACATTTCTAAGCAAGTAACCACAAAGCTAG CCTACAGGGGCAAGGTTGGAATCAGCTACCAGTTTACTCCAGAAATATCTTTGGTGGTAGGTGGGT TCTACCACGGACTCTTTGACGAGTCTTACAAGGACATACCCGCACATAACAGTGTAAAGTTC CCCG GAGAAGCAAAAGCCTCAGTCAAGGCACATATTGCTGATTACGGTTTTAACCTTGGAGCAAGATTCC TGTTCAGCTAAGGATCCGG-3,
注：下划线加粗部分为第一轮引物序列，加粗倾斜灰色部分为第二轮引物的引物序列;下游引物均为列出序列的反向互补序列。
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B.4 山羊无浆体glta基因位点片段参考序列(GenBank Accession No. MH716411.1)
5,-GGTATTCTGCGTACCAGAGGGTATGACATTGCAGATCTTGTCACGACAGGTGGCGGGTTC TGCAGCGTTGCTCATCTCCTGTTGCACGGTGCCCTACCGCAAGGGCGCGAGCTGGATGATTTTGCT TCCGCTGTGGGCAATGAGTGCCATGTACCCGCGCAGGTGGTAAACGTGATTAAATCTTTGCCCAGC AGTGCGCATCCCATGGCGATACTAATCGCGAGTTTTGTTACACTTGCCGCCTGCTACCACGCCGAG AATTCCATAGATCCACTAAAGAGCGCAATAGTAGCTATATCCAAAGTACCCGGGATTGTTGCAGCCA TCTATAGGCACACTTCAGGTATGCCCGCTGTGGAGGCGGACCCAAATCTGGGGTACGTGCAGAACT TTGTGAAAATGATGTTTGGTGATCTGGGTAGTACGCGTCAGAGCGTTATATGCAGGGCGCTAGAGT CGATATTCATAATGCATGCGGACCACGAACAAAACGCCTCTACCGCTACAGTGAGAGTAACCGGTT CTGCTGGGGCGAATCTATTTGCCTGCTTGAGTGCAGGTGCTGCAACTTTGTGGGGGCCAGCTCATG GGGGAGCTAACGAGGCGGTCGTCAGGATGCTTGAGGAAATTGGCAGCCCCGAAAGGGTGGGCAT GTTCATTCAGAGAGTGAAGGACAAAAAGGATGGAGTGAGGCTTATGGGCTTTGGCCATAGGGTCT ACAAGAATTACGATCCAAGAGCGCTTATCATAAGGGACATTTGCAAAGAGACACTGCACGAGCTC GGCACAAGCGATCCTCTGTTGGATGTTGCTATTGAGCTTGAAAGAGTGGCCTTGGAGGACGAGTAT TTCGTCAAGCGCTTCCTGTATCCGAACGTTGACTTT-3´
注：下划线加粗部分为第一轮引物序列，加粗倾斜灰色部分为第二轮引物的引物序列;下游引物均为列出序列的反向互补序列。
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附 录 C
(资料性)
四种无浆体巢氏 PCR 扩增特异性引物序列
四种无浆体巢氏PCR的引物的名称与序列见表C.1。
表C.1 四种无浆体巢氏PCR引物序列
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附 录 D
(资料性)
巢氏 PCR 反应
D.1 第一轮PCR反应体系
第一轮 PCR 扩增反应体系见表D.1。
表D.1 第一轮PCR扩增反应体系(25 μL)
D.2 第二轮PCR反应体系
第二轮 PCR 扩增反应体系见表 D.2。
表D.2 第二轮PCR扩增反应体系(25 μL)
D.3 嗜吞噬细胞无浆体PCR反应程序
嗜吞噬细胞无浆体第一轮和第二轮 PCR 扩增反应程序见表 D.3。
表D.3 嗜吞噬细胞无浆体第一轮和第二轮PCR扩增反应程序
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D.4 牛无浆体PCR反应程序
牛无浆体第一轮和第二轮 PCR 扩增反应程序见表 D.4。
表D.4 牛无浆体第一轮和第二轮PCR扩增反应程序
D.5 绵羊无浆体PCR反应程序
绵羊无浆体第一轮和第二轮 PCR 扩增反应程序见表 D.5。
表D.4 绵羊无浆体第一轮和第二轮PCR扩增反应程序
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D.6 山羊无浆体PCR反应程序
山羊无浆体第一轮和第二轮 PCR 扩增反应程序见表 D.6。
表D.6 山羊无浆体第一轮和第二轮PCR扩增反应程序
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