常见二宿主、三宿主硬蜱在兔体上的繁殖技术规范
1 范围
本文件规定了实验室繁殖常见二宿主、三宿主硬蜱的术语和定义、设施要求(光照培养箱和兔房)、繁殖管理技术以及动物福利与伦理的要求。
本文件适用于二宿主和三宿主常见硬蜱在新西兰白兔上繁殖。
本文件适用于不携带人畜共患病病原的清洁蜱繁殖。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 3095 环境空气质量标准
GB 14925 实验动物 环境及设施
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
NY/T 1167 畜禽场环境质量标准及卫生控制规范
RB/T 061 实验动物安乐死技术规范
T/CVMA 228 普通级实验兔饲养管理规范
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
硬蜱 hard ticks
硬蜱是蜱螨亚纲Acari寄螨总目Parasitiformes蜱目Ixodida硬蜱科Ixodidae所含蜱类的简称，身体具有几丁质的盾板，故称硬蜱。它们暂时性寄生在陆地脊椎动物体表，主要宿主为家畜，也包括人。随着气候变暖和人类活动的频繁干预，各种蜱媒病日益严峻，给畜牧业和人类健康带来极大危害。
3.2
二宿主蜱 two-host ticks
幼虫到若虫的发育阶段不离开宿主，在同一宿主上完成，成虫则需要寻找另一个宿主再行吸血寄生的蜱称为二宿主蜱。其生活史为：卵孵化出幼虫后，幼虫寻找并附着在第一宿主上吸血直至饱血，但并不脱离宿主，直接在宿主上蜕皮变为若虫并继续吸血，饱血后从该宿主上脱落，蜕皮变为成虫;成虫寻找第二宿主再行吸血，饱血后脱离第二宿主，在环境中完成产卵。
3.3
T/CVMA 357—2026
三宿主蜱 three-host ticks
幼虫、若虫和成虫三个阶段分别需要在三个不同的宿主上吸血寄生的蜱称为三宿主蜱。其生活史为：卵孵化出幼虫后，幼虫会寻找并附着在第一宿主上吸血直至饱血，然后从宿主体上脱落，蜕皮变为若虫;若虫再寻找第二个宿主再行吸血，饱血后从宿主体上脱落，蜕皮变为成虫;成虫最后寻找第三宿主再行吸血，饱血后脱离宿主，在环境中完成产卵。
3.4
光照培养箱 illuminated incubator
是一种集光照、温度、湿度控制于一体的环境调控设备，能够为生物(如昆虫、植物、微生物)提供一个稳定、均匀且可控的人工气候环境。
4 生物安全要求
实验室生物安全要求参照 GB19489 的规定执行。特别注意下列事项：
养殖过程中，操作人员身体的任何部位都避免与蜱直接接触;使用之后的新西兰白兔应立即处死并进行消毒处理;严防养殖的蜱逃逸;弃用的蜱，在丢弃之前均处死并进行消毒处理。
5 光照培养箱的选择和使用
5.1 光照培养箱的选择
用于非寄生期硬蜱(卵、幼虫、若虫、成虫)的保存，通过稳定的温、湿度与光周期控制，保障蜱的生长发育节律一致，为后续实验提供均一的实验材料。在保存活蜱时，光照培养箱的选择十分关键。根据大部分硬蜱的生存适宜温度及湿度重点考虑以下因素：①温度：可调控，范围4 ℃ ~ 44 ℃(或更大范围)，精度±1,;②相对湿度：可调控，范围 50 % ~ 94 %;③光照强度：0 ~ 30000 lux 可调，且可设定光周期。
5.2 光照培养箱的使用
将培养箱置于实验室内阴凉干燥、通风良好的区域，远离热源及阳光直射;保持放置平稳，防止移位。同时，为保证有效散热，与墙壁之间距离应大于10 cm ， 箱体侧面应有5 cm 间隙，箱体顶部至少应有30cm 空间，保证培养箱内环境恒定，定时对环境温度及培养箱进行监测，确保一切正常，符合实验要求。同时在培养箱的四壁涂抹凡士林或粘性胶带并定期检查，作为防止蜱逃逸的物理屏障。
5.3 替代方法
如果无光照培养箱，可选用干燥器作为替代，在干燥器中添加预先制备好的饱和 NaCl 或 KCl 溶液，在干燥器的托盘上放置一些纱布，一是避免装蜱的管子掉入饱和盐水中，二是起维持湿度的作用。干燥器可放置在室温阴暗处，维持正常的自然光。同时在干燥器盖子附近的内外壁涂抹凡士林或粘性胶带并定期检查，作为防止蜱逃逸的物理屏障。
6 兔房建设要求
6.1 基本要求：主要用于新西兰白兔的饲养，为寄生期硬蜱(幼虫、若虫、成虫)提供稳定的供血体系，保障其顺利完成吸血及发育过程。
T/CVMA 357—2026
6.2 场地选择：通风、排水良好。
6.3 环境控制：内部安装空调，保证室内温度适合新西兰白兔生存，场地干净，按照 GB 14925 的相关要求执行。
6.4 防逃逸处理：墙体、地面、天花板采用无缝材料(如耐腐蚀瓷砖、密封涂料)铺设，接缝处用防水密封胶填充，杜绝蜱通过缝隙攀爬逃逸;门窗缝隙应涂抹凡士林或粘性胶带;饲养室入口处安装连续不间断的隔离水槽以防止蜱逃逸。
6.5 空气质量要求：符合 GB 3095 中环境空气质量功能区二类区要求。
6.6 水质要求：符合 NY/T 1167 中畜禽饮用水的相关要求。
6.7 清洁与灭蜱处理：对兔粪定期清理，参考有关硬蜱综合防治技术要求对兔房定期清洁，并进行灭蜱。
7 繁殖管理
7.1 蜱种源管理
建立种源管理记录表，登记蜱种来源，野外采集的要记录蜱种名、来源地(包括 GPS 坐标)、采集人、宿主物种、采集时间、采集生境;实验室繁殖的要记录蜱种名、繁殖人，并生成二维码标签。
7.2 繁殖条件
7.2.1 维持兔房温度恒定，气温稳定在 26 ℃左右。
7.2.2 兔房内可根据需要配备相应数量的兔笼，采用单笼饲养模式(每笼饲养 1 只新西兰白兔)。每日定时饲喂新西兰白兔全价颗粒饲料确保实验兔营养均衡，及时清理笼内兔粪、残留饲料及垫料等污物，并进行灭蜱及消毒处理。
7.2.3 选择身体强健的新西兰白兔作为硬蜱繁殖宿主。
7.2.4 将新西兰白兔耳朵根部或背部的毛发用理毛器清理干净，并用白棉布依据兔耳、兔背的尺寸，制备适配对应部位的白棉布套(耳套为圆筒状，背套上部为圆筒状但贴近背部区域为喇叭形)(见图 1、图 2);将布套对应贴合兔耳或兔背区域后，一端用医用胶带或胶水环绕固定于耳根处或背部周边部位，随后将蜱放入布套内，再用橡皮筋扎紧布套的开口端，防止蜱爬出。
T/CVMA 357—2026
图1 兔耳上饲喂蜱及耳套的切面图
图2 兔背上饲喂蜱及背套的切面图
7.3 繁殖方法
7.3.1 二宿主蜱的繁殖方法
二宿主蜱的繁殖具体流程如下：将由卵孵化的饥饿幼虫接种于新西兰白兔体表，幼虫吸血 3 ~ 5 d后饱血，在原宿主体表上直接蜕皮发育为若虫(与幼虫相比，若虫体型显著增大，足由 3 对增至 4 对)，新蜕皮的若虫会持续叮咬宿主，直到饱血后才主动脱离宿主。从饥饿幼虫到若虫饱血脱离，整个阶段历时 10 余天到数十天，具体时间因蜱类属种差异而异。若虫饱血脱落后，需及时收集到培养管中，置于培养箱的管架上，经数十天可蜕皮为成虫(与若虫相比，成虫体型进一步明显增大，身体腹面具生殖孔)。蜕皮后的饥饿成虫可接种到第二宿主体表，吸血 4 ~ 10 d 饱血，之后脱离宿主。饱血雌蜱脱落后也需及时收集到培养管中并放置培养箱内待其产卵，子代幼虫孵化后可直接接种新的第一宿主，实现连续培养。需注意，多数饱血雄蜱不主动脱离宿主，需要借助镊子将其回收或处死。
7.3.2 三宿主蜱的繁殖方法
三宿主蜱的幼虫、若虫、成虫阶段分别依赖三个不同宿主，这与二宿主蜱明显不同。具体流程如下：幼虫饱血后会主动脱离原来的第一宿主(与二宿主蜱的幼虫停留在原宿主上直接蜕皮不同)，此时的饱血幼虫需要及时收集到培养管中，置于培养箱的管架上，待其蜕皮为若虫。蜕皮后的饥饿若虫可接种到第二宿主体表，吸血 4 ~ 8 d ，饱血后同样会脱离宿主。脱落的饱血若虫需收集至培养管中，并置于培
T/CVMA 357—2026
养箱中待其蜕皮发育为成虫。蜕皮后的饥饿成虫可接种到第三宿主体表进行吸血。此后的流程(成虫饱血、雌蜱收集产卵、雄蜱处理)与二宿主蜱在第二宿主上的阶段类似。
7.3.3 不同发育期饥饿蜱的准备
7.3.3.1 饥饿幼虫
卵孵化为幼虫后，经过约7 d 时间，幼虫身体完成硬化，即可吸血。
7.3.3.2 饥饿若虫
饱血幼虫脱离宿主后，在光照培养箱中经历数十天的蜕皮期发育为若虫，随后经过约 7 d 的时间，身体完成硬化后即可吸血。
7.3.3.3 饥饿成虫
饱血若虫脱离宿主后，在光照培养箱中经历数十天的蜕皮期发育为成虫，随后经过约 7 天的时间，身体完成硬化后即可吸血。
7.3.4 兔体供血操作
兔子无需麻醉，按7.2.4的方法，将耳套或背套分别固定在新西兰白兔的耳根或背部，次日检查背套或耳套牢固没有破损后，将饥饿蜱放置在耳套或背套中，并用橡皮筋扎紧套口防止蜱爬出。每日打开开口查看蜱的吸血情况。
7.3.5 蜱的吸血
7.3.5.1 幼虫
叮咬在宿主体表的饥饿幼虫吸血3 ~ 5 d饱血，三宿主蜱的幼虫饱血后会主动脱离宿主;二宿主蜱的幼虫饱血后仍叮咬在宿主体表，直接蜕皮为饥饿若虫，继续叮咬宿主。
7.3.5.2 若虫
叮咬在宿主体表的饥饿若虫吸血 4 ~ 8 d 饱血，二宿主和三宿主蜱的若虫饱血后均会主动脱离宿主。
7.3.5.3 成虫
叮咬在宿主体表的饥饿成虫吸血 4 ~ 10 d 饱血并主动脱离宿主。
7.3.6 蜱的培养
7.3.6.1 蜱虫常规培养
将饱血后的蜱轻轻放入15 mL或50 mL的试管，或是规格匹配的离心管内。与此同时，准备好滤纸条，将其沿着长边折叠后再展开，然后缓缓放入离心管底部，用于维持管内湿度。滤纸长度和宽度依据保存管的规格进行调整(宽度略小于保存管的半径，长度小于管底到棉塞的距离)。随后，取适量脱脂棉，将其制成棉塞，在清水中蘸湿后稍稍拧干，以确保其既保有一定湿度又不会有多余水分滴漏，最后将棉塞封住管口。在此过程中，务必对每管蜱做好详尽且准确的标记，详细记录蜱的种类、收集时间、饱血状态等关键信息。完成上述步骤后，将装有蜱的离心管排列在试管架上，将试管架放入光照培养箱内(温度25 ℃ ~ 27 ℃;相对湿度(RH)75 % ~ 95 %;光周期为6 h光照：18 h黑暗)。
7.3.6.2 幼虫培养
饱血脱落的幼虫在培养箱中经过11 ~ 21 d蜕皮为若虫。
7.3.6.3 若虫培养
饱血脱落的若虫在培养箱中经过13 ~ 35 d蜕皮为成虫。
T/CVMA 357—2026
7.3.6.4 成虫培养
饱血脱落的成虫在培养箱中经过5 ~ 30 d开始产卵，产卵期一般经历9 ~ 35 d。
7.3.6.5 卵的孵化
卵经过25 ~ 45 d孵化为幼虫。
7.3.7 供血兔的养护
新西兰白兔的养护应遵循T/CVMA 228中的规定。在被蜱吸血的过程中，除日常饮食的照顾外，更要注意新西兰白兔的健康状态，如出现皮肤溃疡、体重急剧下降甚至呼吸急促等症状，要及时进行干预，包括松绑耳套、转移寄生蜱等措施。
7.3.8 蜱的驯化
对于最适宿主不是新西兰白兔的蜱种，需要进行实验室驯化才能长期在实验室内稳定繁殖。引入实验室后，最初可采用“胁迫饲养 ”策略，强制蜱在新西兰白兔上完成第一次吸血。此后， 连续传代并逐代进行优势个体筛选。筛选那些在新宿主上表现出高附着率、短吸血期、高饱血重量和产卵能力强的个体用于下一代繁殖。通过这种迭代筛选，可以富集适应新西兰白兔的基因型个体，建立起稳定适应的实验室蜱株。
8 动物福利与伦理
8.1 所有涉及宿主动物的实验方案须提前通过实验单位伦理委员会审批。
8.2 供血动物按实验动物福利伦理相关规定处理，如需进行安乐死的，可参照 RB/T 061 的有关规定进行。确保操作过程符合伦理，将处死后的动物尸体暂存于尸体冰箱以便后续统一焚烧或参照实验动物饲养管理相关技术要求进行处理。
8.3 遵循“3R 原则 ”(替代、减少、优化)，减少不必要的实验动物和蜱类使用量。
9 生物安全与应急处置
本标准适用于不携带人畜共患病病原的清洁蜱繁殖，但仍然存在被蜱叮咬的风险。在涉及蜱类操作的生物安全实验室中，为防止其逃逸，必须配备专用的蜱类逃逸应急箱并制定严格的应急处置措施。应急箱包含杀虫剂、乳胶手套以及LED放大镜。一旦发生逃逸，应立即报告并封锁现场，科研人员需先自查并进行系统性搜寻，仔细检查缝隙角落，发现后用镊子捕获或用药剂喷杀。
T/CVMA 357—2026
附 录 A (资料性)
硬蜱的生活史
硬蜱的生活史包括卵、幼虫、若虫和成虫，后3个时期均为自由活动期。雌蜱饱血后离开宿主，经一段时间才开始产卵，这一时期称为产卵前期;卵产出后经胚胎发育到幼虫孵出，这一时期称为孵化期;新孵化的幼虫、新蜕皮的若虫和成虫，均需要经过一段时间，才能叮咬宿主吸血，这段时间称休止期或静止期。幼虫孵出后经休止期，开始寻找宿主进行血餐，饱血后经过一定天数的蜕皮期发育为若虫;若虫再吸血，饱血后蜕变为成虫。这种从雌蜱开始吸血到下一代成虫出现称为一个生活周期，即一代。
根据蜱的宿主更换次数和蜕皮地点，其生活史可以分成一宿主型、二宿主型和三宿主型。其中三宿主型的生活史最常见，三宿主蜱的生活史见图A.1。幼虫孵出后便到植被或动物巢穴中寻找宿主，此时的宿主为第一宿主;幼虫饱血后从宿主上脱落，在附近的自然环境中蜕皮成为若虫，若虫再寻找宿主吸血，此时的宿主为第二宿主;若虫饱血后再次离开宿主蜕变为成虫，成虫再寻找新的宿主，此时的宿主为第三宿主;交配后的成虫饱血后，雌蜱在附近的隐蔽环境中开始产卵，完成其生命周期。这种在个体发育的3 个阶段都需要寻找新宿主的发育模式称为三宿主生活周期包括花蜱属、硬蜱属和血蜱属的所有种，以及革蜱属、扇头蜱属和璃眼蜱属的多数种类。
图A.1 硬蜱三宿主生活史
对于二宿主型的蜱，饱血幼虫一直吸附在宿主身上并蜕皮，只在若虫饱血后才脱离宿主，其生活史见图A.2。如麻点璃眼蜱、囊形扇头蜱(Rhipicephalus bursa)和以兔子为宿主的小亚璃眼蜱。
T/CVMA 357—2026
图A.2 硬蜱二宿主生活史
在一宿主型的蜱中，幼虫在宿主身上经历3 次吸血和2 次蜕皮，最后饱血雌蜱脱离宿主，一宿主生活史见图A.3。如微小扇头蜱。
图A.3 硬蜱一宿主生活史
评论