农业农村部公告 第864号-15-2024 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂大豆SHZD3201转化体特异性PCR方法

中华人民共和国国家标准《耐除草剂大豆SHZD3201转化体检测方法》主要内容总结

• 规定了耐除草剂大豆SHZD3201转化体特异性PCR的定性和定量检测方法。
• 适用于大豆及其制品中SHZD3201转化体成分的检测，涵盖实时荧光PCR定性/定量及普通PCR定性三种方法。

• 引用农业部公告、NY/T标准等文件，涉及DNA提取、内标基因检测（如Lectin基因）、抽样方法等。
• 关键引用：
  • 农业部1485号公告-4-2010（DNA提取）
  • 农业部2031号公告-8-2013（大豆内标基因检测）
  • NY/T 672（通用检测要求）

• ​​转化体特异性序列​​：外源插入片段与大豆基因组的连接区序列。
• ​​阳性质控品​​：含0.1%~1.0%转基因成分的标准物质或验证样品。
• ​​校准品​​：用于绘制标准曲线的梯度稀释样品（需≥5个浓度）。
• ​​ΔCt值​​：转化体特异性序列与内标基因Ct值的差值。
• ​​ΔΔCt值​​：试样ΔCt与阳性质控ΔCt的差值，用于半定量判断。

• ​​检测方法选择​​：根据需求选用三种方法（实时荧光定性/定量、普通PCR）。
• ​​试剂与模板通用性​​：不同方法的试剂、材料、模板可交叉使用。

​​检测方法细节​​

• ​​原理​​：通过引物/探针扩增内标基因（Lectin）和SHZD3201特异性序列，依据Ct值和扩增曲线判断结果。
• ​​关键试剂​​：
  • ​​内标引物/探针​​：扩增118bp片段（Lectin基因）。
  • ​​SHZD3201引物/探针​​：扩增120bp片段（探针标记FAM/BHQ1等）。
• ​​操作步骤​​：
  1. ​​DNA提取​​：每个试样取3个平行子样。
  2. ​​质控设置​​：阴性（非转基因大豆）、空白（水）、阳性（0.1%~1.0%转基因）。
  3. ​​扩增程序​​：95℃预变性5min，40循环（95℃ 15s→60℃ 60s）。
• ​​结果判定​​：
  • ​​阳性​​：内标和转化体均扩增（Ct≤36）。
  • ​​半定量​​：ΔΔCt≤-0.4时，含量≥阳性质控；ΔΔCt>0.4时，含量低于阳性质控。
• ​​检出限​​：0.05%（约20拷贝/反应）。

• ​​原理​​：通过标准曲线计算转化体与内标基因的拷贝数比值，精确测定含量。
• ​​校准品制备​​：梯度稀释纯合转化体DNA（涵盖定量限0.1%至更高浓度）。
• ​​关键步骤​​：
  1. ​​标准曲线绘制​​：Ct值与拷贝数对数的线性关系（R²≥0.98，斜率-3.6~-3.1）。
  2. ​​不确定度评定​​：预评定标准不确定度（u0=0.0287，ur=0.0658），扩展不确定度U=2u。
• ​​结果表述​​：
  • ​​定量结果​​：以“平均值±扩展不确定度”表示（如0.5%±0.1%）。
  • ​​定量限​​：0.1%（约40拷贝/反应）。

• ​​原理​​：通过普通PCR扩增172bp的特异性片段，电泳检测条带。
• ​​关键试剂​​：
  • ​​内标引物​​：扩增210bp（Lectin基因）。
  • ​​SHZD3201引物​​：扩增172bp（附录A.2序列）。
• ​​操作步骤​​：
  1. ​​扩增程序​​：35循环（94℃ 30s→58℃ 30s→72℃ 30s）。
  2. ​​电泳验证​​：琼脂糖凝胶成像，比对分子量标准。
• ​​结果判定​​：
  • ​​阳性​​：内标和172bp条带均出现。
  • ​​阴性​​：仅内标条带或无条带。
• ​​检出限​​：0.1%（约40拷贝/反应）。

• ​​A.1 实时荧光PCR扩增序列​​（120bp）：
  • 引物SHZD3201-qF/qR及探针SHZD3201-qP靶向外源插入片段与基因组的连接区。
• ​​A.2 普通PCR扩增序列​​（172bp）：
  • 引物SHZD3201-F/R靶向特定区域，用于电泳确认。

• ​​质控要求​​：所有检测均需设置空白、阴性、阳性质控，且结果符合预期（如空白无扩增）。
• ​​不确定度管理​​：定量方法需通过标准物质验证，实验室可自定义评定流程。
• ​​结果矛盾处理​​：多数结果优先原则（如3个平行样中2个阳性则判定阳性）。

• ​​定性筛查​​：快速判断样品是否含SHZD3201（如市场监管抽检）。
• ​​定量分析​​：精确测定转基因含量（如标识合规性验证）。
• ​​科研验证​​：通过测序确认扩增片段特异性（附录A序列比对）。

• ​​多重质控​​：严格的内标基因（Lectin）监控DNA提取有效性。
• ​​半定量设计​​：ΔΔCt值初步判断含量范围，减少定量检测的负担。
• ​​标准化流程​​：从抽样、DNA提取到数据分析的全程标准化，确保结果可比性。

• ​​引物/探针设计​​：严格基于附录A序列，避免非特异性扩增。
• ​​仪器校准​​：实时荧光PCR需定期校准孔间温度差异（<1.0℃）。
• ​​安全操作​​：溴化乙锭（EB）替代染料推荐，减少致癌风险。

​​总结​​：该标准系统性地规范了耐除草剂大豆SHZD3201的PCR检测方法，覆盖定性与定量需求，强调质控与标准化流程，确保检测结果的准确性与可靠性，适用于市场监管、科研及生产质量控制等多场景。