农业农村部公告 第864号-16-2024 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂大豆中黄6106转化体特异性PCR方法 ,该文件为pdf格式 ,请用户放心下载!
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资源简介
中国转基因耐除草剂大豆中黄6106检测标准总结
一、标准概况
- 标准号：农业农村部公告第864号-16-2024
- 名称：转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂大豆中黄6106转化体特异性PCR方法
- 实施日期：2024年12月30日
- 适用范围：大豆及其制品中黄6106转化体成分的定性和定量检测。
二、规范性引用文件
- 包括农业部1485号公告-4-2010（DNA提取）、2031号公告-8/19-2013（定性PCR、抽样方法）及NY/T 672（通用要求）。
三、关键术语
- 转化体特异性序列：外源插入片段与大豆基因组的连接区序列（含5'或3'端）。
- 阳性质控品：含0.1%~1.0%目标成分的标准物质或验证样品。
- 校准品：用于定量标准曲线的梯度稀释DNA样本（≥5个浓度梯度）。
- ΔCt值：目标序列与内标基因的Ct值差值；ΔΔCt值：试样与阳性定量质控品的ΔCt差值。
四、检测方法概览
| 方法类型 | 原理 | 应用场景 | 检出限/定量限 |
|---|---|---|---|
| 实时荧光PCR定性 | 通过引物/探针扩增目标序列，根据Ct值判定阳性/阴性；ΔΔCt判断含量高低。 | 初步筛查，快速定性判断 | 检出限0.05% |
| 实时荧光PCR定量 | 校准品建立标准曲线，计算拷贝数比值（转化体含量）。 | 精确测定转基因成分含量 | 定量限0.1% |
| 普通PCR定性 | 常规扩增后电泳分析，通过条带确认目标序列存在。 | 低成本筛查，实验室基础检测 | 检出限0.1% |
五、核心检测流程
1. 实时荧光PCR定性（方法一）
- 引物/探针：
- Lectin内标：lec-1215F/lec-1332R，探针lec-1269P（118bp）。
- 中黄6106：ZH6106-qF/qR，探针ZH6106-qP（96bp）。
- 反应程序：95℃预变性5min；40循环（95℃ 15s，60℃ 60s）。
- 结果判定：
- 阳性：目标序列和内标Ct≤36，且ΔΔCt≤-0.4时含量≥质控品。
- 阴性：仅内标扩增或无扩增。
2. 实时荧光PCR定量（方法二）
- 校准品制备：纯合转化体DNA梯度稀释（涵盖5浓度）。
- 计算公式：
- 标准曲线：Ct = a + b·lgc（R²≥0.98，斜率-3.6~-3.1）。
- 含量计算：转化体拷贝数/内标拷贝数 ×100%。
- 质控要求：
- 阳性定量质控品偏差需在允许范围内（如标准物质偏差≤2u_bias）。
3. 普通PCR定性（方法三）
- 引物：
- Lectin内标：lec-1672F/lec-1881R（210bp）。
- 中黄6106：ZH6106-F/R（243bp）。
- 反应程序：35循环（94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s）。
- 结果确认：电泳观察目标条带，必要时测序验证。
六、质量控制要求
- 质控品设置：
- 阴性：非转基因大豆。
- 空白：水。
- 阳性：含目标序列的标准物质。
- 数据有效性：
- 内标必须扩增（Ct≤36），空白无扩增。
- 定量方法需验证校准曲线线性及质控品偏差。
七、附录关键信息
- 附录A：提供中黄6106特异性序列：
- 实时荧光PCR靶标：96bp（3'端连接区，外源23bp+大豆73bp）。
- 普通PCR靶标：243bp（外源174bp+大豆69bp）。
八、技术参数
| 参数 | 实时荧光定性 | 实时荧光定量 | 普通定性 |
|---|---|---|---|
| 检测时间 | ~2小时 | ~2小时 | ~4小时 |
| 灵敏度 | 0.05% | 0.1% | 0.1% |
| 设备需求 | 荧光PCR仪 | 荧光PCR仪 | 常规PCR仪 |
| 结果判读方式 | Ct值分析 | 标准曲线计算 | 电泳/测序 |
九、应用意义
- 为转基因大豆中黄6106的标识监管、贸易检测提供标准化方法。
- 三种方法覆盖不同场景需求，兼顾快速筛查与精确定量。
- 严格质控确保检测结果准确，符合中国转基因生物安全管理要求。
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