农业农村部公告 第864号-17-2024 转基因植物环境安全检测 外源杀虫蛋白对非靶标生物影响 青翅蚁形隐翅甲

主要内容总结

• ​​文件名称​​：转基因植物环境安全检测外源杀虫蛋白对非靶标生物影响青翅蚁形隐翅甲（农业农村部公告第864号-17-2024）。
• ​​实施日期​​：2024年12月30日。
• ​​归口单位​​：全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会。
• ​​起草单位​​：农业农村部科技发展中心、中国农业科学院植物保护研究所、华中农业大学。

• ​​目的​​：检测转基因植物外源杀虫蛋白对青翅蚁形隐翅甲（Paederus fuscipes Curtis）的潜在经口毒性。
• ​​适用对象​​：外源基因表达的杀虫蛋白，需与植物中表达的蛋白具有实质等同性（参照农业部1485号公告-17-2010）。

• ​​外源杀虫蛋白​​：转基因植物中外源抗虫基因表达的蛋白。
• ​​经口毒性​​：杀虫蛋白通过饲料摄入对生物生存和发育的影响。
• ​​LD₅₀​​（半数致死剂量）：导致50%死亡率时的蛋白剂量（基于第7天数据）。
• ​​MTD​​（最大耐受剂量）：试验中不引起死亡的最大剂量。

• ​​方法​​：将杀虫蛋白混入人工饲料饲喂青翅蚁形隐翅甲幼虫，对比处理组与对照组的死亡率差异。
• ​​对照设置​​：
  • ​​阴性对照​​：仅含溶剂的饲料（如PBS）。
  • ​​阳性对照​​：含1500 μg/g重铬酸钾（K₂Cr₂O₇）的饲料。
• ​​剂量设置​​：处理组剂量为自然暴露量的10倍以上，若显著影响则需多剂量试验计算LD₅₀。

• ​​试剂与材料​​：
  • ​​杀虫蛋白来源​​：转基因植物提取或微生物表达（需等同性验证）。
  • ​​人工饲料​​：全机能肝粉（猪肝50%、鸡肝20%、鹅肝15%、红枣10%、低聚半乳糖5%）与蜂蜜按5:1混合。
  • ​​试验昆虫​​：实验室多代饲养的青翅蚁形隐翅甲初孵幼虫（≤24h）。
  • ​​营养补充​​：试验第6-8天补充10头/天的褐飞虱若虫。
• ​​仪器设备​​：分析天平（0.01mg精度）、冷冻干燥仪、光照培养箱（28±1℃, RH 65-80%, 光周期12h:12h）等。

1. ​​饲料制备​​：
   • 杀虫蛋白溶解后与全机能肝粉混合，冷冻干燥保存（≤1个月）。
   • 使用前与蜂蜜混合，现配现用。
2. ​​试验操作​​：
   • 单头幼虫置于含腐殖土的指型管中，每日更换饲料，持续14天。
   • 每组至少3重复，每重复≥20头幼虫。
3. ​​数据记录​​：第7天和第14天统计存活率。

• ​​有效性标准​​：
  • 阴性对照组死亡率＜30%。
  • 阳性对照组死亡率＞80%且显著高于阴性组。
• ​​数据分析​​：
  • 计算死亡率（公式：死亡率=死亡数/总数×100%）。
  • 统计方法：Dunnett's test或Mann-Whitney U检验。
  • 结果表述：
    • 若处理组死亡率显著高于对照组，计算LD₅₀。
    • 若无法计算LD₅₀，则给出MTD（最大试验剂量）。

• ​​全机能肝粉制备​​：
  • ​​肝粉​​：猪、鸡、鹅肝经70℃烘干24h后研磨过筛（100目）。
  • ​​红枣粉​​：去核烘干后研磨过筛。
  • ​​混合比例​​：猪肝粉:鸡肝粉:鹅肝粉:红枣粉:低聚半乳糖=10:4:3:2:1。

• ​​等同性验证​​：杀虫蛋白需符合农业部1485号公告要求。
• ​​剂量设置科学性​​：预实验确定正式试验剂量范围。
• ​​环境控制​​：严格维持温度、湿度及光照条件。
• ​​数据严谨性​​：需满足统计学显著性差异标准。

• 为评估转基因植物对非靶标昆虫（青翅蚁形隐翅甲）的生态风险提供标准化方法，确保转基因作物的环境安全性。