农业农村部公告 第864号-14-2024 转基因植物及其产品成分检测 抗虫玉米浙大瑞丰8转化体特异性PCR方法

中华人民共和国国家标准《转基因植物及其产品成分检测 抗虫玉米浙大瑞丰8转化体特异性PCR方法》总结

• ​​标准编号​​：农业农村部公告第864号一14一2024
• ​​发布日期​​：2024年12月30日
• ​​归口单位​​：全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会
• ​​起草单位​​：农业农村部科技发展中心、北京农业职业学院、上海市农业科学院

适用于玉米及制品中抗虫玉米浙大瑞丰8转化体成分的定性和定量检测，涵盖实时荧光PCR定性、实时荧光PCR定量（转化体拷贝数比值）及普通PCR定性三种方法。

三、核心内容概览

• ​​转化体特异性序列​​：外源插入片段与玉米基因组的连接区序列，包含玉米基因组和载体T-DNA部分序列。
• ​​阳性质控品​​：含0.1%-1.0%转基因成分的标准物质或验证样品，用于质量控制。
• ​​校准品​​：用于绘制标准曲线的梯度稀释样品，需含5个有效浓度。
• ​​ΔCt值​​：转化体特异性序列Ct值与内标基因（zSSIIb）Ct值的差值。
• ​​ΔΔCt值​​：试样ΔCt与阳性定量质控品ΔCt的差值，用于初步判定含量高低。

• ​​方法选择​​：根据检测需求选择定性或定量方法，试剂、材料及模板可通用。
• ​​模板要求​​：DNA提取需符合农业部1485号公告，试样需制备3个平行子样。

四、检测方法详解

• ​​原理​​：通过引物/探针扩增内标基因（zSSIIb）和转化体特异性序列，依据扩增曲线判定结果。
• ​​关键参数​​：
  • ​​引物/探针​​：zSSIIb（88 bp）和RF8（92 bp）特异性序列（见附录A）。
  • ​​反应体系​​：25 μL体系，含MgCl₂、dNTPs、Taq酶及模板（内标2.0 μL，转化体4.0 μL）。
  • ​​程序​​：95℃预变性5 min，40循环扩增（95℃ 15 s，60℃ 60 s）。
• ​​结果判定​​：
  • ​​阳性​​：内标和转化体均扩增（Ct≤36）。
  • ​​阴性​​：仅内标扩增，或两者均未扩增。
• ​​检出限​​：0.05%（反应体系中约20拷贝）。

• ​​原理​​：基于校准品标准曲线计算转化体拷贝数与内标基因的比值，确定转基因含量。
• ​​校准品制备​​：梯度稀释纯合转化体DNA，涵盖5个浓度（定量限0.1%，约40拷贝）。
• ​​数据分析​​：
  • ​​标准曲线​​：Ct值与拷贝数对数线性拟合（R²≥0.98，斜率-3.6~-3.1）。
  • ​​不确定度评估​​：通过联合验证数据计算扩展不确定度（U=2u）。
• ​​结果表述​​：含量表示为“c±U”，低于定量限时注明“含量低于0.1%”。
• ​​定量限​​：0.1%（反应体系中约40拷贝）。

• ​​原理​​：通过普通PCR扩增特异性片段（265 bp），电泳确认条带大小。
• ​​引物设计​​：RF8-RB-F/R引物扩增右侧翼序列（见附录A）。
• ​​反应程序​​：35循环（94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s）。
• ​​结果判定​​：凝胶电泳观察预期条带，测序验证特异性。
• ​​检出限​​：0.1%（反应体系中约40拷贝）。

五、质量控制与验证

• ​​质控品设置​​：阴性（非转基因玉米）、空白（水）及阳性对照（含0.1%-1.0%转化体）。
• ​​合格标准​​：
  • 阳性对照：内标和转化体均扩增（Ct≤36）。
  • 阴性对照：仅内标扩增。
  • 空白对照：无扩增。
• ​​数据验证​​：定量方法需通过偏倚分析（|偏差|<2倍不确定度）及变异系数（≤25%）验证。

六、附录与序列信息

• ​​附录A​​：提供转化体特异性序列的详细信息：
  • ​​实时荧光PCR​​：92 bp序列（5'端外源插入，3'端玉米基因组）。
  • ​​普通PCR​​：265 bp右侧翼序列（玉米基因组与外源插入交界区）。

七、安全与注意事项

• ​​溴化乙锭警告​​：具致癌性，操作需防护，建议使用替代核酸染料。
• ​​专利声明​​：文件可能涉及专利，发布机构不承担识别责任。

八、实施意义

本标准为抗虫玉米浙大瑞丰8的转基因成分检测提供标准化方法，确保检测结果的准确性、可比性及法律效力，适用于市场监管、安全评价及国际贸易等领域。