前 言
本文件按照GB/T１?１—２０２０«标准化工作导则 第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规则
起草.
请 注意本文件的某些内容有可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本文件由农业农村部种业管理司提出.
本文件由全国农作物种子标准化技术委员会(SAC/TC３７)归口.
本文件起草单位:全国农业技术推广服务中心、中国农业科学院作物科学研究所、黑龙江省种业技术
服务中心、山西省农业种子总站、内蒙古自治区农牧业技术推广中心、河北省种子管理总站、安徽省种子管
理总站.
本文件主要起草人:邱丽娟、刘丰泽、关荣霞、任雪贞、郭潇阳、刘谢香、王羡国、孟全业、邓澍、郑静宜、
张文晓、孙全、金石桥、晋芳.
Ⅱ
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大豆品种真实性鉴定 SSR 分子标记法
１ 范围
本文件规定了大豆[Glycinemax (L?)Merr?]品种真实性鉴定(simplesequencerepeat,SSR)分子
标记法术语和定义、原理、检测方案、检测程序和结果报告.
本文件适用于大豆品种真实性验证和品种真实性身份鉴定,不适用于实质性派生品种(EssentialdeＧ
rivedvariety,EDV)的鉴定.
２ 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,
仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本
文件.
GB/T３５４３?１ 农作物种子检验规程 总则
GB/T３５４３?２ 农作物种子检验规程 扦样
GB/T３５４３?５ 农作物种子检验规程 真实性和品种纯度鉴定
GB/T６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法
３ 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
３?１
品种真实性 varietygenuineness
供检样品与标准品种是否相符.
３?２
品种真实性验证 varietyverification
与其对应品种名称的标准样品比较,检测证实供检样品的品种名称与标注是否相符.
３?３
品种真实性身份鉴定 varietyidentification
经分子技术检测并通过相应品种指纹数据比对平台筛查比较,确定供检样品的真实品种名称.
３?４
标准样品 standardsample
国家指定机构保存的代表品种特征特性的实物样品或DNA 样品.
３?５ SSR 指纹数据比对平台 SSRfingerprintblastplatform
采用SSR标记的标准化方法对品种标准样品的等位变异进行检测,并运用计算机数据库技术和网络
信息技术所构建的品种分子数据信息的检索比对载体.
３?６
参照样品 referencesample
具有SSR位点上主要等位变异的品种,用于辅助确定试验样品的等位变异,校正仪器设备的系统误差.
３?７
引物组合 primerpanel
最大限度区分大豆品种的一套引物.
１
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４ 缩略语
下列缩略语适用于本文件.
bp:碱基对(basepair)
CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide)
DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)
dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyＧribonucleosidetriphosphate)
PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis)
PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)
SSR:简单重复序列(simplesequencerepeat)
Taq 酶:耐热DNA 聚合酶(TaqＧDNApolymerase)
５ 原理
大豆不同品种的基因组存在着能够世代稳定遗传的简单重复序列(SSR)的重复次数差异.这种差异
可以通过从有代表性的试验样品中提取DNA,用SSR引物进行扩增和电泳检测出来,因此可以利用扩增
片段大小区分不同品种.
依据SSR标记检测原理,采用SSR引物,通过与标准样品比较或与SSR指纹数据比对平台比对的方
式,对品种真实性进行验证或身份鉴定.真实性验证依据规定数目引物的SSR 位点差异数目而判定,品
种真实性身份鉴定依据被检SSR位点无差异原则进行筛查和鉴定.
６ 检测方案
６?１ 总则
对于真实性鉴定,引物、检测平台、样品状况不同,其检测结果的准确度、精确度可能有所不同.应依
据“适于检测目的”的原则,统筹考虑检测规模和检测能力,选定适宜的检测平台、样品状况,制订相应的检
测方案.
在严格控制条件下,合成选择的引物,按照确定的检测平台对试验样品按DNA 提取、PCR 扩增、电
泳、数据分析的程序进行检测.
按规定要求填报检测结果,检测报告应注明检测方案所选择的影响检测结果的关键信息.
DNA 提取、PCR扩增和电泳的技术条件要求,在适于检测目的和不影响检测质量的前提下,按照检
测平台的要求,允许对本文件的规定做适当调整.
６?２ 检测平台
６?２?１ 品种真实性验证可采用变性PAGE垂直板电泳或者毛细管电泳,PAGE电泳宜在同一电泳板
上比较试验样品和标准样品;真实性身份鉴定,宜采用毛细管电泳,利用SSR指纹数据比对平台进行鉴
定.
６?２?２ 对于试验样品数量较多的,可将组织研磨仪、DNA 自动提取、自动移液工作站、高通量PCR扩增
仪、DNA 分析仪进行组合,以提高检测的综合效率.
６?３ 引物
６?３?１ 开发３８对SSR引物作为品种真实性验证和身份鉴定的引物(见表１)
表１ 引物信息
编号引物名称染色体退火温度,℃ 引物序列(５′Ｇ３′)
PG０１ Gm０１６ ９ ６０ 正向:AGTTAGGGTGATCAGAAAACTGTAA
反向:GATTGCTCCAACGTATTAAGCACTT
PG０２ Gm００８ ５ ６０ 正向:TGAAACCTGGAAAAAGATACGTGTG
反向:GTTGAAGGAAATGCTTCAAACCAAC
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表１ (续)
编号引物名称染色体退火温度,℃ 引物序列(５′Ｇ３′)
PG０３ Gm０３４ １８ ６０ 正向:AGTTGGTGTTTTCTTGTGGTTTTCT
反向:CGTACTCTGTACTGGGAGCTAATTA
PG０４ Gm０２３ １３ ６０ 正向:TTTATGACTCTTTGCAGCAAGAAGG
反向:AATGATCTAATGTGTGACCATGCAC
PG０５ Gm０３９ ２０ ６０ 正向:TGCTTCCCTATGCAAAAAGATTGAG
反向:TCAAGTATGGTGGAAAACTTGAAGC
PG０６ Gm０３７ １９ ６０ 正向:TCACCTATTTTCAAATTATGCGCTCA
反向:ATGGAAATACTGAATGAAAGCATATTG
PG０７ Gm０３０ １６ ６０ 正向:TCACGAAAGTTTTTCTGTAACATCT
反向:GCCTGTATATAAAGGTGCACAAAGT
PG０８ Gm００６ ４ ６０ 正向:GAGCTATTCCTTTGATTGAAACCCA
反向:TTGGGAGCTTATACTGAGGTTTCTT
PG０９ Gm０３１ １７ ６０ 正向:GCTTACATGCAACCTATAAGGCATT
反向:AGGTTGTCAAATGATGAGAAGTCTT
PG１０ Gm０１３ ７ ６０ 正向:TGGTGACACTGTATACCAAACTCTT
反向:GGACTCTGCCTCGTAATATTACCAT
PG１１ Gm０１５ ８ ６０ 正向:TTCTTGAGAATTACTGTGTCCCTGT
反向:CCTGATGGGATGCACTTTGTATATT
PG１２ Gm０１０ ７ ６０ 正向:GCTAACCCGCTCTATGTTAAAGTTC
反向:ATAGAGACAGAGCCAACTCAAACTT
PG１３ Gm００１ １ ６０ 正向:AACACCAAACTATCACTAGGTTTGC
反向:CCAGGTCACTTACACCTTAACACTA
PG１４ Gm０２９ １６ ６０ 正向:TCACTTGACTAATCGTGTCATGACA
反向:AGAATGGACTAACGTTGAGAGGATT
PG１５ Gm０１２ ７ ６０ 正向:TCACCATTTAGATTCTTCTCAGGCA
反向:TTCGTGAGCTATTGTTTTTCATCGT
PG１６ Gm００７ ５ ６０ 正向:AGTCATGTCAGCAATTCAGCTTATG
反向:GTCTCCCTCTCTTTCATTTCTACGA
PG１７ Gm０３３ １８ ６０ 正向:TCAAATTTTAACCTCAGAGGACAGG
反向:TGACAATGAAGATAATGATAACAAAATTAGT
PG１８ Gm０３２ １８ ６０ 正向:ATCCCCAAAGTTATGGAAGAGTCAA
反向:TCAAGAAACAAAAGGTATGCATGCT
PG１９ Gm０２７ １５ ６０ 正向:ATCATAGTCAGGGGTGGACCTATAT
反向:AACAACATCATTCTGATCAGTGGTG
PG２０ Gm０２２ １２ ６０ 正向:GACACCAATCAAAAATTGAACTGCA
反向:ACTCAACCAATAAAAGAGCATGCAA
PG２１ Gm０７０ ２０ ６０ 正向:GATGTCTGCCTCTATGGTAGCTTAA
反向:AGTAGTTGTAAGCATACCACCATGA
PG２２ Gm０６５ ４ ６０ 正向:AAAACATCTCTTCATGCTGTTGTCC
反向:AAACCTAACTAAGCTTCGGTCTCAA
PG２３ Gm０４３ １０ ６０ 正向:TCAAGCACTTTGATTTCCATTCTGT
反向:CGTGTAGTATAGTTTTGAAAATGGCG
PG２４ Gm０４５ ２ ６０ 正向:AGTTGGTTAAGTCGATTAGGCTTGA
反向:GCCAAAAATGAGCAAAAATGCAACA
PG２５ Gm０５４ ３ ６０ 正向:TTAAGCAGTTCCTCTCATCACGTAA
反向:TGGATAGTTGACTTTGTTTGGTTGG
PG２６ Gm００４ ３ ６０ 正向:AAAAACCATCCTTACAAAACTGCCA
反向:TCAGTGGGATCTGATTGTATTTTACC
PG２７ Gm０５１ １７ ６０ 正向:TGTATACACGAAAGATGGAATATTCTTTT
反向:TGCCGGAAAATTTTATGGCATAGAT
PG２８ Gm０５３ １３ ６０ 正向:TGTTTAGTCAATTCAGGTCGATAAGT
反向:GTTCACATGCTTGTACCGATTGATA
３
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表１ (续)
编号引物名称染色体退火温度,℃ 引物序列(５′Ｇ３′)
PG２９ Gm０４６ １ ６０ 正向:CCAGAGTTAACATCTCGGTTTGATG
反向:AATTTGGCCAAATTCAAACTGGTCA
PG３０ Gm０５２ ６ ６０ 正向:TAATTCTAGCTGGCCTTTAGAACGT
反向:ATATTTAAGTGGCGTTGGATTCGAC
PG３１ Gm０５９ ４ ６０ 正向:TATCCATCGTGTTGCTGTCATACTT
反向:ACCATTGTCCTTATCATATTCGTTAAAAA
PG３２ Gm０４９ １２ ６０ 正向:CGCCCACCAATAGAAATAATTGTGA
反向:TGTGATCGGATGTTAATTAGCTTTTTCA
PG３３ Gm０５５ ７ ６０ 正向:TTTTAGCCAAAGAACATGTTATGGT
反向:ACTTTTATTCAACATGCTTTTCATAAGT
PG３４ Gm００５ ４ ６０ 正向:GCACACATCATTTCTTTGTTTGACC
反向:TGTGTTCCGATTTTGATTGCGATAA
PG３５ Gm０５６ ８ ６０ 正向:GCAATCAATTTGTGTCTTTATGCCC
反向:TTTTGAATCCTAGACATGCATGCAA
PG３６ Gm０１９ １０ ６０ 正向:TCTTTGTAAGATCACGCCATTATTT
反向:GTTGCATTGCACATTAGGTTTTCTG
PG３７ Gm０１４ ７ ６０ 正向:ACAAAAATCAACAACGTTAACAATATAAATT
反向:GGCAGGGTGGAAGTGAATTTTT
PG３８ Gm０４８ ２０ ６０ 正向:TACGTATTTTCATTGCACAAGTTGT
反向:TGTCTATGTTCTACCATTAAATGATGACA
注:本表中３８对引物均为中国农业科学院作物科学研究所自主开发.
６?３?２ 品种真实性验证允许采用序贯方式.若PG０１~PG１０检测到可以判定不符结果的差异位点数
的,可终止检测.若采用前１０对引物未达到可以判定不符结果的差异位点数时,则继续完成引物PG０１~
PG１０的检测,以此类推.也可直接采用表１的３８对SSR引物进行检测.
６?３?３ 品种真实性鉴定采用表１的３８对SSR引物构建试验样品指纹,与SSR指纹数据比对平台比较筛
查与试验样品指纹一致的品种.
６?４ 样品
６?４?１ 送验样品为种子、幼苗、叶片等组织或器官.需要扦样的样品数量应符合GB/T３５４３?２的规定.
６?４?２ 试验样品不少于３０个个体,可以采用混合检测或单个个体检测.
６?５ 检测条件
真实性鉴定应在有利于检测实施的控制条件下进行,包含但不限于下列条件:
a) 检测员熟悉所使用检测技术的知识和技能;
b) 所有仪器与使用的技术相匹配,并已经过定期维护、验证和校准;
c) 使用适当等级的试剂盒、灭菌处理的耗材;
d) 使用校准检测结果评定的适宜参照品种.
７ 仪器设备、试剂和溶液配制
７?１ 仪器设备
７?１?１ DNA 提取
高速冷冻离心机、水浴锅、紫外分光光度计、酸度计、移液器、组织研磨仪等.
７?１?２ PCR 扩增
PCR扩增仪、移液器等.
７?１?３ 电泳
７?１?３?１ 变性PAGE垂直板电泳
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高压电泳仪、垂直板电泳槽及制胶附件、胶片观察灯、水平摇床、数码相机或凝胶成像系统、移液器等.
７?１?３?２ 毛细管电泳
DNA 分析仪等.
７?１?４ 其他器具
微量移液器、电子天平、高压灭菌锅、电热恒温鼓风干燥箱、加热磁力搅拌器、冰箱等.
７?２ 试剂
７?２?１ DNA 提取
液氮、CTAB、氯化钠、乙二胺四乙酸二钠(EDTAＧNa２?２H２O)、三羟甲基氨基甲烷(TrisＧbase)、氯
仿、异戊醇、乙醇、盐酸.
７?２?２ 引物合成
选用变性PAGE垂直板电泳,只需合成普通引物.选用荧光毛细管电泳,需要在上游或下游引物的
５′端或３′端标记与毛细管电泳仪发射和吸收波长相匹配的荧光染料.
７?２?３ PCR 扩增
DNA、引物、dNTPs、１０×PCRBuffer(含MgCl２)、Taq 酶、ddH２O 或者２×Taq Mix反应混合液.
７?２?４ 电泳
７?２?４?１ 变性PAGE垂直板电泳
丙烯酰胺(Acrylamide)、N,NＧ亚甲基双丙烯酰胺(MethyleneＧbisＧacrylamide)、尿素、去离子甲酰胺
(Formamide)、溴酚蓝(Bromophenolblue)、二甲苯青、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、硼酸、乙醇(９５％)、亲和
硅烷(Bindingsilane)、剥离硅烷(Repelsilane)、过硫酸铵、冰醋酸、四甲基乙二胺(TetramethylethylenediＧ
amine,TEMED)、蒸馏水、无水乙醇、去离子水、硝酸银、氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠(EDTAＧNa２ ?
２H２O)、甲醛、DNA 分子量标准.
７?２?４?２ 毛细管电泳
与使用的DNA 分析仪型号相匹配的分离胶、分子量内标、去离子甲酰胺、电泳缓冲液等.
７?３ 溶液配制
DNA 提取、PCR扩增、电泳、银染的溶液按照附录A 规定的要求进行配制,所用试剂均为分析纯.
试剂配制所用水应符合GB/T６６８２规定的一级水的要求,其中银染溶液的配制可以使用符合三级要
求的水.
８ 检测程序
８?１ DNA 提取
８?１?１ CTAB法
选取试样的叶片２００mg~３００mg,加液氮迅速研磨成粉末,转入２?０ mL 的离心管中,每管加入
７００μL经６５℃预热的CTAB提取液,充分混匀,６５℃水浴６０min,其间轻摇颠倒混匀３次.每个离心管
加入７００μL氯仿∶异戊醇(２４∶１)混合液,上下轻摇颠倒多次混匀直至液体呈乳白色,１２０００r/min离
心１５min.取上清液移至新的离心管中,加入等体积的氯仿,上下轻摇颠倒多次混匀５min,１２０００r/
min离心１０min.取上清液移至新的离心管中,加入等体积预冷的无水乙醇,颠倒摇匀后放于－２０ ℃冰
箱静置３０min,４℃１２０００r/min离心１０min.弃上清液,７０％乙醇漂洗１次,１２０００r/min离心１０
min,弃上清液,自然干燥DNA 沉淀１０min.将干燥的DNA 溶于１００μL０?１×TE缓冲液中,检测浓度,
置于－２０℃备用.该方法也适用于种子DNA 的提取.
８?１?２ 试剂盒法
选用适宜SSR标记法的商业试剂盒,并经验证合格后使用.DNA 提取方法,按照试剂盒提供的使用
说明进行操作.具体引物荧光信息见附录B.
注:DNA提取可选８?１?１、８?１?２或其他达到PCR扩增质量要求的方法.
８?２ PCR 扩增
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８?２?１ 反应体系
PCR扩增反应体系的总体积和组分的终浓度根据表２进行配制,可依据试验条件不同作相应调整.
表２ PCR 扩增反应体系
反应组分原浓度终浓度反应体积,μL
１０×PCRBuffer(含MgCl２) １０× １× ２?０
dNTP ２?５mmol/L ０?２５μmol/μL ２?０
Taq 酶５U/μL ０?０５U/μL ０?２
SSR正向引物２μmol/L ０?１μmol/L １?０
SSR反向引物２μmol/L ０?１μmol/L １?０μL
DNA ２０ng/μL ５ng/μL ５μL
ddH２O — — ８?８μL
注:使用２×Taq Mix混合液进行PCR 扩增,可直接在反应体系中加入相应的引物和模板DNA,加入量参照表２,用
ddH２O补齐至反应总体积２０μL.
８?２?２ 反应程序
反应程序中各反应参数可根据PCR扩增仪型号、酶、引物等的不同做适当调整.通常采用下列反应
程序:
a) 预变性:９５℃,５min;
b) 扩增:９５℃变性３０s,６０℃退火４min,共３２个循环;
c) 终延伸:７２℃,５min.
扩增产物置于４℃保存.
８?３ 扩增产物分离
８?３?１ 变性PAGE垂直板电泳
８?３?１?１ 制胶
蘸洗涤灵用清水仔细反复将玻璃板刷洗,再用蒸馏水冲洗干净,竖置晾干.将玻璃板水平放置(玻璃
板的规格宜为４５cm×３５cm),用９５％乙醇纵向横向各擦拭板面３次.５min后,用亲和硅烷溶液擦拭板
面３次(擦拭方式同上),晾置５min后备用.同样刷洗背板,平放晾干,用９５％乙醇纵向横向各擦拭背板
表面３次,晾置５min.再用剥离硅烷溶液擦拭背板表面３次(擦拭方式同上),晾置５min后备用.
将间隔条、附着板和背板组装成凝胶夹层装置,水平放置,用夹子在两侧夹好固定,用水平仪检测是否
水平.量取８０mL６％变性聚丙烯酰胺凝胶溶液,加入１８０μL１０％ 过硫酸铵和６０μLTEMED,轻轻混
匀后利用灌胶瓶将其灌入夹层中,将鲨鱼齿梳的平齐端插入两板之间的胶液５mm~６mm.胶聚合１?５h
后,轻轻拔出梳子,用清水洗干净备用.
８?３?１?２ 变性
将PCR扩增产物加入５μL上样缓冲液离心混匀.９５ ℃变性５min后,取出迅速放置于冰上,冷却
１０min待用.
８?３?１?３ 电泳
a) 将聚合好的胶板安装于电泳槽上,在电泳正极槽(下槽)加入６００mL的０?５×TBE缓冲液,负极
槽(上槽)加入６００mL的０?５×TBE缓冲液,拔出样品梳,在１８００V 恒压预电泳(１０min~２０
min),用塑料滴管清除加样槽孔内的气泡和杂质,将样品梳插入胶中１mm~２mm.每一个加
样孔加入５μL变性样品,在１８００V 恒压下电泳.
b) 电泳的适宜时间参考二甲苯青指示带移动的位置和扩增产物预期片段大小范围(见表B?１)加以
确定.二甲苯青指示带在６％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中移动的位置与２３０bp扩增产物泳
动的位置大致相当.扩增产物片段大小在(１００±３０)bp、(１５０±３０)bp、(２００±３０)bp、(２５０±
３０)bp范围的,电泳参考时间分别为０?７h、１?０h、１?５h、２?０h.电泳结束后关闭电源,取下玻
璃板并轻轻撬开,凝胶附着在长玻璃板上.
６
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８?３?１?４ 银染
将凝胶板置于装有固定液的塑料盒内,轻轻摇荡１０min后取出,在双蒸水漂洗３min;将凝胶板放置
新配染色液中,轻轻摇荡２０min后取出,在双蒸水快速漂洗,时间不超过１０s;将凝胶板放置于显影液中,
轻轻摇荡,直至出现带纹.待带纹清晰后取出,迅速置于固定液中定影２ min,然后在双蒸水中漂洗
２min;取出凝胶板室温下自然晾干,放在胶片观察灯上观察,记录结果,拍照保存.
注:固定液、染色液和显影液的用量,以没过胶面为准.
８?３?２ 毛细管电泳
８?３?２?１ 将按照预先确定的组合引物,等体积取同一组合中不同荧光标记引物的扩增产物,充分混匀.
从混合液中吸取１μL,加入DNA 分析仪专用９６孔上样板上.每孔再分别加入０?２μL 分子量内标和
８?８μL去离子甲酰胺,９５℃变性５min,取出立即置于冰上,冷却１０min以上,离心１０s后备用.
８?３?２?２ 打开DNA 分析仪,检查仪器工作状态和试剂状态.
８?３?２?３ 将装有扩增产物的９６孔上样板放置于样品架基座上,将装有电极缓冲液的buffer板放置于
buffer板架基座上,打开数据收集软件,按照DNA 分析仪的使用手册进行操作.DNA 分析仪将自动运
行参数,并保存电泳原始数据.
８?４ 数据分析
电泳结果需要通过规定程序进行数据读取以降低误读率.在引物等位变异片段大小范围内,对于毛
细管电泳,特异峰呈现为稳定的单峰型;对于变性PAGE垂直板电泳,特异谱带呈现稳定的单谱带.
采取混合样检测的,无论是毛细管电泳还是变性PAGE垂直板电泳,结果表明在引物位点出现因样
品异质性而无法识别特异谱带或特异峰的,应采用单个个体独立检测,试样至少含有３０个个体.
８?４?１ 变性PAGE垂直板电泳
对甄别后的特异谱带进行扩增片段大小的读取,统一采用两段式数据记录方式.纯合位点数据记录
为X/X ,非纯合位点数据记录为X/Y(其中X 、Y 分别为该位点两个等位基因扩增片段大小),小片段数
据在前,大片段数据在后,缺失位点数据记录为０/０.
８?４?２ 毛细管电泳
８?４?２?１ 对于毛细管电泳,由于不同引物扩增产物表现不同、引物不对称扩增、试验条件干扰等因素,可
能出现不同状况的峰型,按照以峰高为主、兼顾峰型的原则依据下列规则进行甄别、过滤处置:
a) 对于连带(pullＧup)峰,即因某一位置某一颜色荧光的峰值较高而引起同一位置其他颜色荧光峰
值升高的,应预先将其干扰消除后再进行分析;
b) 对于(n＋１)峰,即同一位置出现２个相距１bp左右的峰,应视为单峰;
c) 对于高低峰,应通过设定一定阈值不予采集低于阈值的峰;
d) 对于有２个及以上特异峰,应考虑是由非纯合SSR位点或混入杂株所致.
８?４?２?２ 导出电泳原始数据文件,采用数据分析软件对数据进行甄别.
a) 设置参数:在数据分析软件中预先设置好panel、分子量内标、panel的相应引物的Bin(等位变异
片段大小范围区间);
b) 导入原始数据文件:将电泳原始数据文件导入分析软件,选择panel、分子量内标、Bin、质量控制
参数等进行分析;
c) 甄别过滤处置数据:按８?４?２?１的规定执行.
分析软件会对检测质量赋以颜色标志进行评分,绿色表示质量可靠无需干预,红色表示质量不过关或
未落入Bin范围内,黄色表示有疑问需要查验原始图像进行确认.
数据比对采用８?４?３?１、８?４?３?２方式的,应分别通过同时进行试验的标准样品、参照样品(依据引物
选择少量的对照),校准不同电泳板间的数据偏差后再读取扩增片段大小.甄别后的特异峰落入Bin范围
内,直接读取扩增片段大小;若其峰大多不在Bin范围内,可将其整体平移尽量使峰落入Bin设置范围内
后读取数据.
８?４?３ 数据比对
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８?４?３?１ 采用与标准样品比较的,对甄别后的特异谱带(见８?４?１)或特异峰(见８?４?２?１),按照在同一电
泳板上的试验样品与标准样品逐个位点进行两两比较,确定其位点差异.
８?４?３?２ 采用毛细管电泳与SSR指纹数据比对平台比对的,按照数据导入模板的要求,将数据及其指纹
截图上传到SSR指纹数据比对平台,进行逐个位点在线比对,核实确定相互间的指纹数据的异同.
８?４?３?３ 采用PAGE垂直板电泳与SSR指纹数据比对平台比对的,按照数据导入模板的要求,将数据上
传到SSR指纹数据比对平台,进行逐个位点的两两比对,核实确定相互间的指纹数据的异同.
注:采用PAGE垂直板电泳与SSR指纹数据比对平台比对较为困难,建议作为参考使用,比对前采取以下措施:
a) 读取扩增产物片段大小数据的,等位变异可参照附录C(见表C?１),试验参照品种可参照附录D
(见表D?１),同时在同一电泳板上电泳;
b) 电泳时间足够,符合８?３?１?３的要求;
c) 试验样品存在扩增片段为一个基序差异的,按片段大小顺序重新电泳进行复核确定后读取.
９ 鉴定意见
９?１ 检测结果用试验样品和标准样品的位点差异数表示,根据检验结果进行鉴定意见判断,一般份为３
类:排除属于同一品种、不确定是否为同一品种和不排除属于同一品种.对于有异议的样品,可以按照
GB/T３５４３?５的规定进行田间小区种植鉴定.
９?２ 鉴定意见可参考以下原则:
a) 供检样品与标准样品或SSR指纹数据平台某品种比较检测出差异位点数大于４,排除两者为同
一品种;
b) 供检样品与标准样品或SSR指纹数据平台某品种比较检测出差异位点数为１、２、３或４,不确定
两者为同一品种;
c) 供检样品与标准样品或SSR指纹数据平台某品种比较检测出差异位点数为０,不排除两者属于
同一品种.
１０ 结果报告
１０?１ 按照GB/T３５４３?１的检验报告要求,对品种真实性验证或身份鉴定的检测结果进行填报.
１０?２ 对于真实性验证,选择下列方式之一进行填报:
a) 通过对引物,采用电泳方法进行检测,与标准样品比较未能检测出位点差异.
b) 通过对引物,采用电泳方法进行检测,与标准样品比较检测出差异位点个,
差异位点的引物编号为,鉴定意见为.
１０?３ 对于品种身份鉴定,采用下列方式进行填报:
a) 通过对引物,采用电泳方法进行检测,经与SSR 指纹数据库筛查,试验样品与
品种未发现位点差异.
b) 通过对引物,采用电泳方法进行检测,经与SSR指纹数据比对平台筛查,检测到供
检样品与品种位点差异为１或２,鉴定意见为: .
c) 通过对引物,采用电泳方法进行检测,经与SSR指纹数据比对平台筛查,未检测到
与供检样品位点一致品种,无法鉴定品种身份.
１０?４ 属于下列情形之一的,需在检验报告中注明:
a) 试验样品低于６?４?１规定数量;
b) 与试验样品比较的标准样品的来源;
c) 与SSR指纹数据比对平台进行数据比对;
d) 试验样品遗传不稳定严重的位点(引物编号)清单.
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NY/T２５９５—２０２５
附 录 A
(资料性)
溶液配制
A?１ DNA 提取
A?１?１ CTAB提取液
称取２０g的CTAB(２０g/L)、８１?８１６g的NaCl(１?４ mol/L)、２?９２２５g的EDTAＧNa２ ?２H２O
(１０mmol/L)、１２?１１４g的Tris(１００ mmol/L),溶于适量水中,调pH 至８?０,加水定容至１０００ mL,
１２１℃高压灭菌２０min,４℃贮存.DNA 提取前,按照每１００mLCTAB溶液加入２mLβＧ巯基乙醇在
６５℃水浴锅中预热.
A?１?２ １０×TE缓冲液
称取０?２９２３g的EDTAＧNa２?２H２O(１０mmol/L)、１?２１１４g的Tris(１００mmol/L),溶于适量水
中,调pH 至８?０,加水定容至１００mL,１２１℃高压灭菌２０min,４℃储存.
A?１?３ ０?１×TE缓冲液
量取１０mL的１０×TE缓冲液,加水定容至１０００mL,４℃储存.
A?２ SSR 引物
用ddH２O 分别配制上游引物、下游引物终浓度为１０μmol/L的储存液,－２０℃储存.
A?３ 电泳
A?３?１ 亲和硅烷溶液
量取２mL亲和硅烷原液与５００mL的无水乙醇混匀,于常温避光干燥处保存备用.
A?３?２ 剥离硅烷溶液
量取１０mL剥离硅烷原液与４９０mL的无水乙醇混匀,于常温避光干燥处保存备用.
A?３?３ １０×TBE缓冲液
称取１０８g的Tris、５５g的硼酸、７?４４g的EDTAＧNa２?２H２O 溶于适量水中,搅拌至完全溶解,加水
定容至１０００mL后,于常温避光干燥处保存备用.
A?３?４ ０?５×TBE缓冲液
量取２５０mL的１０×TBE缓冲液,加水定容至５０００mL,于常温避光干燥处保存备用.
A?３?５ ４５％聚丙烯酰胺凝胶的配制
称取４３４g的丙烯酰胺、１６g的N,NＧ亚甲双丙烯酰胺溶于适量水中,搅拌至完全溶解.加水定容至
１０００mL后,用普通滤纸过滤２次,于常温避光干燥处保存备用.
A?３?６ ６％变性聚丙烯酰胺凝胶的配制
称取２１０g的尿素、１３３mL的４５％聚丙烯酰胺凝胶、１００mL的１０×TBE,加去离子水搅拌至完全溶
解.定容至１０００mL后,用普通滤纸过滤２次,于常温避光干燥处保存备用.
A?３?７ ２０％过硫酸铵溶液
称取２０g过硫酸铵溶于１００mL水中,４℃储存备用.
A?３?８ ０?５mol/LEDTA 溶液
称取１８?６１g的EDTAＧNa２?２H２O 溶于水中,调pH 至８?０,加水定容至１００mL,１２１ ℃高压灭菌
２０min,４℃储存.
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NY/T２５９５—２０２５
A?３?９ 上样缓冲液
取９８mL去离子甲酰胺、２mL的０?５mol/LEDTA、０?２５g的溴酚蓝和０?２５g的二甲苯青混合摇
匀,４℃备用.
A?４ 银染
A?４?１ 固定液(１０％醋酸)
２００mL冰醋酸,加水定容至２０００mL.
A?４?２ 染色液(０?１５％硝酸银溶液)
３g硝酸银,加水定容至２０００mL.
A?４?３ 显影液(１?２５％氢氧化钠、０?１２９５％甲醛溶液)
２０００mL蒸馏水中加入２５g氢氧化钠和７mL甲醛.
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NY/T２５９５—２０２５
附 录 B
(资料性)
３８对标记荧光的SSR 引物分组方案
大豆３８对SSR引物的荧光标记及分组见表B?１.
表B?１ ３８对标记荧光的SSR 引物分组
分组编号引物名称５′荧光基团
１
PG０１ Gm０１６ FAM
PG０２ Gm００８ FAM
PG０３ Gm０３４ FAM
PG０４ Gm０２３ HEX
PG０５ Gm０３９ HEX
PG０６ Gm０３７ HEX
２
PG０７ Gm０３０ TAMRA
PG０８ Gm００６ TAMRA
PG０９ Gm０３１ ROX
PG１０ Gm０１３ ROX
PG１１ Gm０１５ ROX
３
PG１２ Gm０１０ FAM
PG１３ Gm００１ HEX
PG１４ Gm０２９ TAMRA
PG１５ Gm０１２ TAMRA
PG１６ Gm００７ TAMRA
PG１７ Gm０３３ TAMRA
PG１８ Gm０３２ ROX
PG１９ Gm０２７ ROX
PG２０ Gm０２２ ROX
４
PG２１ Gm０７０ FAM
PG２２ Gm０６５ FAM
PG２３ Gm０４３ FAM
PG２４ Gm０４５ HEX
PG２５ Gm０５４ HEX
PG２６ Gm００４ HEX
PG２７ Gm０５１ HEX
PG２８ Gm０５３ TAMRA
PG２９ Gm０４６ ROX
５
PG３０ Gm０５２ FAM
PG３１ Gm０５９ FAM
PG３２ Gm０４９ FAM
PG３３ Gm０５５ FAM
PG３４ Gm００５ HEX
PG３５ Gm０５６ HEX
PG３６ Gm０１９ HEX
PG３７ Gm０１４ HEX
PG３８ Gm０４８ ROX
注１:毛细管电泳时,每一组别的引物可以组合在一起电泳.
注２:荧光标记仅为示例,如采用其他荧光集团,需用参照样品进行数据校正.
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NY/T２５９５—２０２５
附 录 C
(资料性)
３８对SSR 引物等位变异信息(毛细管电泳)
表C?１列出了３８对引物在已知大豆品种中扩增片段长度范围、主要等位变异扩增片段大小以及参
照样品对应的等位变异信息.
表C?１ 已知品种主要等位变异扩增片段信息
编号名称组别染色体范围片段大小参照样品名称
PG０１ Gm０１６ １ ９ ３２７~３６０
３４２ 浙鲜５号
３４５ 南农９９Ｇ６
３４８ 冀豆１２
３５１ 汾豆７８
３５７ 黑河４５
PG０２ Gm００８ １ ５ ２４１~２７１
２４７ 南农４８
２５０ 湘春豆２６
２５３ 汾豆７８
２５６ 黑河４５
２５９ 南农９９Ｇ６
PG０３ Gm０３４ １ １８ １１１~１５２
１１１ 汾豆７８
１２６ 天隆一号
１２９ 吉育７２
１３９ 冀豆１２
１４２ 浙鲜５号
１４９ 黑河４５
PG０４ Gm０２３ １ １３ ３３２~３８５
３３５ 黑河４５
３３８ 黑河４９
３５６ 汾豆７８
３５９ 南农４８
３６１ 冀豆１２
３６４ 天隆一号
３７９ 湘春豆２６
PG０５ Gm０３９ １ ２０ ２６５~３１３
２６７ 吉育８６
２７０ 华春２号
２７９ 冀豆１２
２８２ 吉育７２
２８５ 浙鲜５号
２９１ 黑河４５
２９６ 南农９９Ｇ６
PG０６ Gm０３７ １ １９ ９３~１７７
９９ 南农９９Ｇ６
１０８ 华夏９号
１２３ 黑河４９
１３２ 吉育８６
１３５ 黑河４５
１３９ 华疆２号
１５０ 冀豆１２
１６４ 浙鲜５号
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NY/T２５９５—２０２５
表C?１ (续)
编号名称组别染色体范围片段大小参照样品名称
PG０７ Gm０３０ ２ １６ １５５~２１６
１５８ 南农４８
１６７ 中黄１３
１７０ 南农９９Ｇ６
１９０ 黑河４５
１９３ 湘春豆２６
１９６ 华夏９号
PG０８ Gm００６ ２ ４ ８６~１５１
８６ 浙鲜５号
１３１ 黑河４５
１３７ 湘春豆２６
１４０ 华夏９号
１５０ 中黄１３
PG０９ Gm０３１ ２ １７ ３４７~３８４
３５０ 南农９９Ｇ６
３５３ 黑河４５
３６１ 吉育８６
PG１０ Gm０１３ ２ ７ ３０４~３１９
３１３ 南农９９Ｇ６
３１６ 湘春豆２６
３１９ 冀豆１２
３３１ 黑河４５
３３４ 南农４８
PG１１ Gm０１５ ２ ８ ２４７~３０５
２７７ 天隆一号
２８５ 黑河４５
２９２ 冀豆１２
２９５ 南农９９Ｇ６
２９８ 华夏９号
PG１２ Gm０１０ ３ ７ １７３~１８７
１７３ 冀豆１２
１７６ 汾豆７８
１７９ 南农９９Ｇ６
１８２ 黑河４５
PG１３ Gm００１ ３ １ ２５３~２８８
２６５ 天隆一号
２７４ 湘春豆２６
２８２ 南农９９Ｇ６
PG１４ Gm０２９ ３ １６ ３２９~３５９
３３５ 天隆一号
３３８ 黑河４９
３４１ 南农９９Ｇ６
３５３ 齐黄３４
３５６ 黑河４５
PG１５ Gm０１２ ３ ７ ２９９~３１９
３０１ 冀豆１２
３０４ 黑河４５
３０７ 吉育８６
３１３ 吉育７２
PG１６ Gm００７ ３ ５ ２２３~２６２
２４３ 南农９９Ｇ６
２４６ 黑河４５
２４９ 湘春豆２６
PG１７ Gm０３３ ３ １８ １３１~１５７
１３４ 南农９９Ｇ６
１５４ 黑河４５
１５７ 齐黄３４
PG１８ Gm０３２ ３ １８ ３００~３２９
３００ 湘春豆２６
３０６ 黑河４５
３０９ 冀豆１２
３２２ 汾豆７８
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NY/T２５９５—２０２５
表C?１ (续)
编号名称组别染色体范围片段大小参照样品名称
PG１９ Gm０２７ ３ １５ ２３０~２７８
２３０ 南农９９Ｇ６
２４３ 齐黄３４
２６３ 吉育８６
２７５ 黑河４５
２７８ 汾豆７８
PG２０ Gm０２２ ３ １２ １３６~１５０
１４０ 黑河４５
１４３ 湘春豆２６
１５０ 南农９９Ｇ６
PG２１ Gm０７０ ４ ２０ ３１７~３６２
３２６ 南农９９Ｇ６
３３８ 湘春豆２６
３４１ 华夏９号
PG２２ Gm０６５ ４ ４ ２８０~３０６
２９４ 冀豆１２
２９７ 南农９９Ｇ６
３００ 吉育７２
PG２３ Gm０４３ ４ １０ ８５~１０５ ８５ 中黄１３
９７ 南农９９Ｇ６
PG２４ Gm０４５ ４ ２ ３２０~３８３
３２８ 冀豆１２
３３１ 浙鲜５号
３３４ 汾豆７８
３５２ 天隆一号
３５５ 中黄１３
３５７ 南农９９Ｇ６
３６３ 吉育７２
PG２５ Gm０５４ ４ ３ ２３９~２８０
２４６ 冀豆１２
２４９ 南农９９Ｇ６
２５８ 浙鲜５号
２６１ 南农４８
２６９ 天隆一号
２７２ 齐黄３４
PG２６ Gm００４ ４ ３ １８９~２１１
１８９ 吉育７２
１９２ 浙鲜５号
１９８ 汾豆７８
２０１ 南农９９Ｇ６
２０８ 中黄１３
２１１ 吉育８６
PG２７ Gm０５１ ４ １７ １２５~１６６
１３１ 邯豆５号
１４１ 吉育７２
１４４ 齐黄３４
１４７ 吉育８６
１６３ 湘春豆２６
１６６ 南农９９Ｇ６
PG２８ Gm０５３ ４ １３ ３２８~３５６
３２８ 齐黄３４
３３３ 中黄１３
３３６ 黑河４９
３４８ 南农９９Ｇ６
３５０ 华疆２号
PG２９ Gm０４６ ４ １ １６７~２１９
１８２ 冀豆１２
２０３ 汾豆７８
２１６ 南农４８
２１９ 苏豆１３
１４
NY/T２５９５—２０２５
表C?１ (续)
编号名称组别染色体范围片段大小参照样品名称
PG３０ Gm０５２ ５ ６ ３４９~３８２
３４９ 湘春豆２６
３６４ 吉育８６
３７３ 南农９９Ｇ６
３７６ 天隆一号
３７９ 沪宁９５Ｇ１
PG３１ Gm０５９ ５ ４ ２７３~３０９
２７３ 天隆一号
２７６ 黑河４５
２７８ 南农９９Ｇ６
２９５ 华夏９号
２９８ 中黄１３
３０１ 齐黄３４
PG３２ Gm０４９ ５ １２ ２１３~２４６
２１３ 中豆４１
２１６ 黑河４５
２３２ 南农９９Ｇ６
２３８ 齐黄３４
PG３３ Gm０５５ ５ ７ １２３~１６２
１２５ 铁丰３１
１２８ 南农９９Ｇ６
１３１ 湘春豆２６
１３４ 冀豆１２
１４７ 黑河４５
１５０ 齐黄３４
PG３４ Gm００５ ５ ４ ２９６~３３７
３０２ 汾豆７８
３１４ 齐黄３４
３２４ 南农９９Ｇ６
３３０ 黑河４５
３３３ 冀豆１２
PG３５ Gm０５６ ５ ８ ２６０~２８７
２６９ 南农９９Ｇ６
２７２ 吉育７２
２７５ 黑河４５
２７８ 中黄１３
PG３６ Gm０１９ ５ １０ １９８~２４０
２０１ 中黄１３
２０４ 南农９９Ｇ６
２１３ 齐黄３４
２１６ 黑河４５
２３６ 浙鲜５号
２３９ 华夏９号
PG３７ Gm０１４ ５ ７ １０７~１４９
１０７ 中黄１３
１１０ 南农９９Ｇ６
１２３ 湘春豆２６
１２６ 冀豆１２
１４５ 邯豆５号
１４９ 吉育７２
PG３８ Gm０４８ ５ ２０ １５５~１７９
１５９ 黑河４５
１６２ 齐黄３４
１７１ 南农９９Ｇ６
１７４ 汾豆７８
１８０ 吉育７２
１５
NY/T２５９５—２０２５
附 录 D
(资料性)
参照品种名单
参照品种名单见表D?１.
表D?１ 参照大豆品种名单
编号品种名称编号品种名称
１ 吉育８６ １０ 南农４８
２ 吉育７２ １１ 浙鲜５号
３ 汾豆７８ １２ 华夏９号
４ 冀豆１２ １３ 邯豆５号
５ 齐黄３４ １４ 苏豆１３
６ 中黄１３ １５ 中豆４１
７ 天隆一号１６ 铁丰３１
８ 湘春豆２６ １７ 黑河４９
９ 南农９９Ｇ６ １８ 沪宁９５Ｇ１
１６
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