ICS 71.100.70 CCS Y42
团 体 标 准
T/CHCIA 010—2023
化妆品皮肤微生态评测指南 微生物组学(扩增子测序)
Guidelines for Evaluating the Effects of Cosmetics on Skin Microbiota
Microbiome (Amplicon Sequencing)
2 0 2 3 - 0 3 - 1 3 发 布
中国日用化工协会 发 布
T/CHCIA 010—2023
前 言
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
本文件由中国日用化工协会提出。
本文件由中国日用化工协会归口。
本文件起草单位：山东福瑞达生物股份有限公司、上海应用技术大学、空军特色医学中心、欧诗漫 控股集团有限公司、德之馨香精香料(南通)有限公司、上海家化联合股份有限公司、SGS通标标准技 术服务(上海)有限公司、仙婷(广州)科技研发有限公司、上海拜思丽实业有限公司、海军军医大学 附属长征医院、上海晓创检测技术有限公司、上海美吉生物医药科技有限公司、浙江清华长三角研究院、 山东大学、复旦大学人类表型组学研究院、北京工商大学、浙江百姿化妆品股份有限公司、中轻日用化 学检验认证有限公司。
本文件主要起草人：杨素珍、李燕、马来记、邵丽、刘玮、温海、霍刚、劳树权、贾海东、杨扬、 符毅敏、梅鹤祥、王莹、韩继臣、李旭辉、孔健、马彦云、宋丽雅、汤辉、姚晨之。
本文件首次发布。
引 言
皮肤是人体最大的器官，作为机体的屏障保护机体免受外来微生物、抗原或有毒物质的侵害。在人 体皮肤表层或毛囊中栖息着大量的微生物，构成了人体皮肤微生物组，也即皮肤菌群，其在维持皮肤健 康中发挥着重要的作用，又被称为皮肤的微生物屏障。皮肤微生物组、宿主皮肤及环境构成皮肤微生态 系统，它们之间相互作用、相互制约，保持协调的、生理的、动态的平衡。平衡的皮肤微生态，有利于 皮肤健康。但在日常生活中，化妆品的频繁使用、过度清洁、过度护理、化学品、药品、过度的紫外线 暴露、不良生活方式、环境污染等因素可导致皮肤微生态失衡。皮肤微生态失衡，皮肤生物屏障削弱或 者破坏，会影响皮肤正常的生理机能，乃至被感染，促进皮肤的老化。
维持皮肤微生态平衡对皮肤健康的重要性逐渐被大家所认知。微生态护肤成为护肤品研发的风向标。 目前行业内对皮肤微生态的概念、微生态化妆品的界定没有明确统一的标准，同时也未有评测皮肤微生 物组的统一方法。随着下一代测序技术和生物信息学的发展，人们对皮肤菌群的组成、结构与功能及其 在维持皮肤健康中的作用有了更深入的了解。作为皮肤微生态中重要角色的皮肤微生物组易受到诸多因 素的影响，其中护肤品的使用影响皮肤微生物组的变化。在微生物组研究中，高通量测序(也即扩增子 测序)和宏基因组测序是最常用的测序方法。宏基因组( Metagenome) 以特定环境下微生物群体基因 组为研究对象，使用鸟枪法进行非指向性测序，不仅能获得环境微生物群落的多样性、物种组成还能进 行功能基因注释，可以鉴定到“种”,目前宏基因组测序成本较高。扩增子测序是一种靶向性方法，针 对细菌16SrRNA 、 真菌18S rRNA和ITS进行测序来研究环境微生物多样性、群落组成和差异分析，一 般可精确到“属”水平，少数可鉴定到“种”。扩增子测序具有测序成本低、周期较短、对样品质量要 求低等优势，现已广泛应用于各种环境中的微生物研究。因此，对于皮肤微生物组的评测方法，本文件 选用扩增子测序进行并规范的开展皮肤微生物组评测，包括测试人群的招募、生物样本的采集、运输、 测序和数据分析等各个步骤。
本文件的建立可指导科研人员开展微生态化妆品的开发和性能评测，并为微生态化妆品的界定和皮 肤微生态的评测提供依据。
化妆品皮肤微生态评测指南 微生物组学(扩增子测序)
1 范围
本文件规定了皮肤微生物组、皮肤微生态和微生态化妆品的术语和定义、皮肤微生物组在扩增子测 序方面的测试方法。
本文件适用于评价调节皮肤微生物组(或皮肤菌群)化妆品的人体测试方法。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件。
《化妆品安全技术规范》
《化妆品安全评估及技术导则》
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
皮肤微生物组 skin microbiome
指所有生活在皮肤上的各类细菌、真菌、病毒等微生物共同构成了皮肤微生物组合，也称之为皮肤 菌群。
3.2
皮肤微生态 skin microecology
皮肤微生物组与其生存的微环境(皮肤、皮肤附属器和外界环境)共同组成的生态系统。 3.3
微生态化妆品 micro-ecological cosmetics
指使用此类产品一定时间后，能够调节皮肤菌群多样性和物种组成而促进皮肤代谢与健康的化妆品。 3.4
α-多样性 alpha-diversity
用于研究环境中微生物的多样性，通过单样本的多样性(α-多样性)分析反映微生物群落的丰富度 和多样性，可通过一系列统计学分析指数评估环境群落的物种丰度和多样性。
3.5
β-多样性 beta-diversity
β-多样性反映不同分组样本间群落组成的相似性或差异性。通过样本层级聚类分析、样本距离热图 (Heatmap图)、主成分 (PCA) 分析和多维分组PCA分析等比较组间β-多样性。
3.6
群落多样性 community diversity
常用香浓指数 (shannon index) 和辛普森指数( simpson index) 来评估群落多样性。香浓指数值越 大，说明群落多样性越高;辛普森指数值越大，说明群落多样性越低。
3.7
群落丰富度 community richness
常用Chao指数、Sobs指数和Ace指数来评估群落丰富度，也即物种总数。Chao指数、Sobs指数和Ace 指数值越大，说明菌落的物种总数越多，群落丰富度越高。
3.8
物种相对丰度 relative abundance of species
群落中某一物种的丰度占所有物种的丰度之和的百分比。
4 基本原则
4.1 人体皮肤微生物组测试前应当遵守伦理学原则要求，人体功效试验之前，被测试产品应按照《化 妆品安全技术规范》《化妆品安全评估技术导则》完成必要的微生物检验、理化检验及化妆品安全评估 工作，保证产品安全，不合格的产品不进行人体功效试验。
4.2 本测试方法适用于产品使用前后或与对照组(侧)的对照。
5 测试原理
通过分析化妆品产品使用前后(或双侧实验，设对侧空白为对照)的皮肤菌群的物种组成和多样性 变化，确定产品是否有调节皮肤菌群的作用。皮肤菌群的变化，目前研究主要为细菌和真菌的变化，可 以采用扩增子测序，通过分析细菌16S rRNA的V1-V2区 、V1-V3区、V3-V4区、V3-V5区、V4-V5区或 V1-V9区(全长测序)和真菌ITS区(内转录间区)等序列变化，获得皮肤样本的序列数，进一步通过 生物信息分析，获得样本的分类操作单元 (OTU) 总数和物种分类信息。
6 测试材料与仪器
6.1 测试材料
所用测试材料如下：
a) 氯化钠，分析纯;
b) 吐温-20,分析纯;
c) 无屑型吸水干纸巾;
d) 无菌采样棉拭子/皮肤取菌胶布/取样刀片;
e) 棉拭子润湿液：配制方法：用去离子水配制含0.9%NaCl-0.1%吐温20的溶液，121℃灭菌20分钟 或采用0.22微米的滤膜过滤除菌;
f) DNA保存液;
g) 微生物DNA提取试剂盒;
h) dsDNA荧光定量检测试剂盒;
i)16S 建库试剂盒;
j) 测序试剂盒。
6.2 测试仪器
所用测试仪器如下：
a) 粉粹研磨仪;
b) 高速低温离心机;
c) 电泳仪;
d) 超微量分光光度计;
e) 基因扩增仪 (PCR仪);
f) 微型荧光计;
g) 测序平台;
h) 超低温冰箱：最低温度可达-80℃。
7 试验前准备
7.1 招募受试者
7.1.1 入选标准
受试者需要符合以下要求：
a) 选择符合产品适用范围的人群;
b) 能理解测试过程，自愿参加试验并签署知情同意书者;
c) 能够按照要求按量使用产品者。
注：试验机构可根据不同测试设备设置合理的筛选值。
7.1.2 排除标准
以下人员不可作为受试者：
a) 怀孕或哺乳期妇女，或近期有备孕计划者;
b) 有银屑病、湿疹、特异性皮炎等现患皮肤病史者以及过敏史者及其他身体系统疾病者;
c) 近3个月内口服或外用过抗生素、皮质类固醇激素等抗炎药物者;
d) 目前或近1个月参加其它临床试验者;
e) 不能按时完成所要求的内容者;
f) 其他临床评估认为不适合参加试验者。
7.1.3 受试者限制
参加测试人员需遵守以下规定：
a) 在试验期间受试部位必须使用试验机构提供的产品，不能使用可能对测试结果有影响的产品;
b) 在试验期间受试者应尽可能保持生活规律，注意饮食健康，同时避免暴晒、室外强力劳动等情 况。
7.2 受试者人数
按7.1.1、7.1.2、7.1.3入选和排除标准选择合格的受试者，确保最终完成测试的有效例数≥30人/组， 每组可酌情增加3～6例。
7.3 环境条件
7.3.1 温度(21±2)℃;
7.3.2 湿度(50±10)%RH;
7.3.3 测试过程中测试者、场所(避免人员流动)、仪器等测试条件应保持一致。
8 受试物
8.1 测试产品
宣称具有调节皮肤微生态(或皮肤菌群)化妆品。
8.2 对照组设置
测试可以设置对照组，对照组可选择空白对照(不使用任何产品)或基质对照，也可以选择使用产 品前后对照。
8.3 测试要求
8.3.1 测试产品测试前进行编盲，提供的产品数量满足受试者累积使用量，随机发放测试产品，并提 供测试产品的使用方法、使用部位、使用手法、每次用量、使用频次、使用注意事项、使用记录表格。
8.3.2 测试产品涂于产品使用部位，而对照产品则涂在相对称的身体部位;如面部护肤品脸颊两侧， 身体护理产品为左右前臂或左右小腿部位等。
9 测试方法
9.1 受试者筛选
按照7.1招募入组受试者，签署书面知情同意书，婴童产品的测试选择儿童受试者时，需由监护人 签署书面知情同意书，并完成调查问卷。可根据实验设计针对性的调查问卷，了解采样时受试者的基本 信息，可涉及志愿者个人基本信息、肌肤状态和生活状况等信息。
9.2 测试
9.2.1 皮肤微生物取样位置和取样时间
取样位置的选择：测试组(侧)与对照组(侧)取样位置分别为两产品的使用部位，采样部位大小 一致，使用前后或对照组宜选择受试者大小一致的同一部位，对照侧宜选择与测试侧对称、大小一致的 部位。
取样时间设定：1)零点取样：受试样品使用前基础点取样;2)测试取样点：受试者使用受试样品 一定时间后的取样点，可根据产品需求自行设定使用受试物后的取样时间和设置多个测试时间点，可与 产品的其他功效测试时间平行。
可根据测试产品要求，自行设定受试者清洁测试部位要求、取样位置与取样时间。皮肤菌群属于低 生物量样本，若清洁后取样，取样时间设置要合适，防止采样量不足达不到测序要求，产生无效样本。
9.2.2 皮肤微生物采样和保存方法
采样方式选择：可依据产品使用部位特点，选择适宜的采样方法。面部皮肤推荐无菌棉拭子采样， 深层皮肤采样或菌群低丰度身体部位(如脚部)可选择如刮取、撕拉等方式。采样部位和采样面积大小： 可参考文献的方法，未有依据可参考时，有必要通过预实验检测采集DNA的量是否满足测序的要求。以 面部皮肤无菌棉拭子取样为例，采用无菌棉拭子蘸取润湿液(0.9% NaCl-0.1%吐温-20),在受试者取 样位置如脸颊(3×3)cm²的区域反复刮拭，刮拭至少30次，应有一定的力度;擦拭期间注意转动拭子， 然后将棉拭子放入收集管内，立即保藏于-80℃冰箱中，采集的微生物样品保藏要避免反复冻融，否则 会改变皮肤菌群的组成。
皮肤微生物样本采集宜由同一人完成，保证采样手法和力度的一致性。如需测定其他皮肤生理参数， 样本采样点不应与生理参数测试点重合，避免探头浸润试剂对菌群的影响。采样环境的监测：采样时准
备空白拭子，在空气中静置片刻后放入采样管，以此作为采样的空白对照样品(因皮肤微生物属于低生 物量样本，建议多做几个空白对照样本)。
产品使用前后、测试组(侧)和对照组(侧)皮肤微生物取样方法一致。
9.2.3 皮肤微生物DNA的提取、纯化和PCR扩增
提取9.2.2中皮肤微生物样品的DNA(DN A提取试剂盒由负责测序的测试公司来提供),检测DNA 的浓度和纯度。依据产品的目的选择16S rRNA或ITS特异性引物进行PCR扩增。
9.2.4 基因测序及数据处理
文库构建和上机测序：使用建库试剂盒进行文库构建，将构建好的文库进行定量和质检。待文库满 足建库要求后，利用基因测序仪进行上机测序。
注：已有商品化的基因测序仪Miseq PE(Paired-endsequencing,PE)300 、NovaSeq PE250。
数据处理：使用分析软件(如， Uparsev,7.0.1090), 根据97%的相似度对序列进行OTU聚类，并 剔除嵌合体。利用核糖体数据库项目 (RDP) 对每条序列进行物种分类注释，设置比对阈值为0.7,分 别比对Silva 16S rRNA和Unite ITS数据库。获得测试皮肤样本的序列数、OTU总数、各分类水平的相关 数据，可对样本的多样性、物种组成和差异等进行相关性分析。
10 数据统计分析
采用统计分析软件进行统计和作图。计量资料表示为：均值±标准差，并进行正态分布检验，符合 正态分布要求时，受试者产品使用前后、受试者测试组(侧)与对照组(侧)比较采用配对t检验，不 符合正态分布要求时，采用两个相关样本秩和检验;试验组与对照组的比较采用独立t检验或秩和检验。 上述统计分析均为双尾检验，显著性水平为α=0.05。
注：可使用的统计分析软件有R语言、vegan包、QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology)。
具体分析采用下列方法：
a) 皮肤菌群多样性分析
通过α-多样性、β-多样性分析来评价样本皮肤菌群的多样性。样本的α-多样性通过常用丰富度指数 sob 、chao和ace, 多样性指数shannon和simpson, 均匀度指数simpsoneven 、shannoneven和群落覆盖度指 数coverage来表示。样本组间的α-多样性差异显著性分析，运用统计学t检验的方法，检测两组之间的指 数值是否具有显著性差异。组间β-多样性分析通过样本层级聚类分析、样本距离Heatmap图、PCA分析 和多维分组PCA分析等来比较。
b) 皮肤菌群物种组成分析
采用物种文氏图 (Venn diagram,Venn图)、群落柱形图(Bar chart,Bar图)、群落饼图(Pie Graph, Pie图)和多级物种旭日图 (Sunburst Chart,Sunburst图)、群落Heatmap图等来呈现物种组成和物种相 对丰度等信息。
c) 差异物种分析
差异物种分析：组间显著性差异检验根据得到的物种相对丰度数据，运用统计学方法，对不同组(或 样本)微生物群落之间的物种相对丰度进行假设检验，评估物种丰度差异的显著性水平，获得组(或样 本)间显著性差异物种。
11 试验结论
根据测试结果，获得受试者使用前后或受试者测试组(侧)与对照组(侧)的皮肤菌群α-多样性、 物种组成和差异物种数据。根据数据类型选择统计学方法进行分析，与使用前或对照组(对侧)相比， 物种α-多样性显著变化或菌属丰度发生显著变化 (P<0.05), 试验结论则认为测试产品具有影响皮肤微 生物组成和多样性的效果。
注：如有验证产品功效需求，可在测试中设置控制组，排除环境影响带来的差异，并结合皮肤生理参数，综合评判 产品调节皮肤微生态的效果。
12 不良反应
试验产品使用期间.测试人员需要随访监测受试者的使用情况。如果出现不良反应. 应立即终止测 试，并对受试者进行护理。对不良反应予以记录。
13 试验报告
试验报告应包括下列内容：
a) 样品信息;
b) 环境条件;
c) 试验内容;
d) 本文件未规定的或任选的任何操作细节，以及会影响结果的任何情况;
e) 结果与结论。
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