中华人民共和国农业行业标准
NY/T 4911—2025
玉米品种及其实质性派生品种鉴定
SNP标记法
Identification of maize (Zea mays L.) varieties and its essentially
derived varieties—SNP marker method
2025-12-09 发布
2026-05-01 实施
中华人民共和国农业农村部 发 布
前 言
本文件按照 GB/T 1 .1—2020« 标准化工作导则 第 1 部分 :标准化文件的结构和起草规则»的规定起草 .
本文件的某些内容有可能涉及专利 . 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 .
本文件由农业农村部种业管理司提出 .
本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC 277)归 口 .
本文件起草单位 :北京市农林科学院玉米研究所 、农业农村部科技发展中心 .
本文件主要起草人 :王凤格 、田红丽 、易红梅 、赵久然 、韩瑞玺 、张秀杰 、杨扬 、王蕊 、范亚明 、葛建镕 、赵怡锟 .
玉米品种及其实质性派生品种鉴定 SNP标记法
1 范围
本文件规定了利用单核苷酸多态性(SNP)标记进行玉米(Zea mays L.) 品种及其实质性派生品种鉴定的原理 、主要仪器设备和试剂溶液配制 、核心位点相关信息 、检测平台的选择 、操作程序 、结果计算 、结果判定与表述。
本文件适用于玉米品种鉴定及其实质性派生品种鉴定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中 ,注日期的引用文件 ,
GB/T 3543 .2 农作物种子检验规程 第 2 部分 :扦样
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19557 .24 植物品种特异性 、一致性和稳定性测试指南 玉米
NY/T 2594 植物品种鉴定 DNA分子标记法 总则
3 术语和定义
NY/T 2594 和 GB/T 19557 .24 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3 .1
单核苷酸多态性 singlenucleotidepolymorphism ,SNP
在基因组水平上单个核苷酸变异所引起的 DNA序列多态性。
3 .2
实质性派生品种 essentialderived variety,EDV
由原始品种实质性派生 ,或者由该原始品种的实质性派生品种派生出来的品种 ,与原始品种有明显区别 ,并且除派生引起的性状差异外 ,在表达由原始品种基因型或者基因型组合产生的基本性状方面与原始品种相同。
3 .3
标准样品 standard sample
国家指定机构保存的具有法定身份的代表品种特征特性的实物种子或 DNA样品。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide) 。
dNTPs:脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphates) 。
EDV:实质性派生品种(essential derived variety)。
PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) 。
SNP:单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism)。
5 原理
可能存在差异 ,这种差异可通过芯片及生物信息学等方法进行检测 ,进而区分不同的品种 .
6 主要仪器设备及试剂
见附录 A.
7 溶液配制
见附录 B. 所用试剂均为分析纯 . 试剂配制所用水应符合 GB/T 6682 规定的一级水的要求 .
8 核心位点相关信息
遴选了 50 000 个 SNP位点作为玉米品种及其实质性派生品种鉴定的核心位点 ,位点信息见附录 C.
9 检测平台的选择
宜选择基于激光微刻 SNP芯片分型的检测平台 . 其他能达到同样效果的方法和 SNP分型平台也可采用 ,所选择的其他分型方案在采用之前应通过技术验证 .
10 操作程序
10 .1 样品准备
送检样品可为种子 、幼苗 、叶片 、果穗等 组 织 或 器 官 . 样 品 需 扦 样 时 , 应 符 合 GB/T 3543 .2 的 要 求 .试验样品取不少于 30 个个体的叶片或其他等效物进行混合分析 ,必要时进行个体检测 .
10 .2 DNA提取
10 .2 .1 CTAB法
取试样的幼苗或叶片约 200 mg, 置 于 2 .0 mL 离 心 管 , 加 液 氮 充 分 研 磨 , 或 取 种 子 充 分 磨 碎 后 移 入2 .0 mL离心管 . 每管加入 700 μL经 65 ℃预热的 CTAB提取液 ,充分混合 , 65 ℃水浴 60 min. 其间不时多次轻缓颠倒混匀 . 每 管 加 入 等 体 积 的 三 氯 甲 烷/异 戊 醇 (24 ∶ 1)混 合 液 , 充 分 混 合 后 静 置 10 min, 12 000 r/min离心 15 min至分相 . 吸取上清液转移至新的离心管中 ,加入等体积预冷的异丙醇 ,轻轻颠
乙,放,i、i,inm.i液加,0700 ,
液 ,充分溶解后备用 .
10 .2 .2 SDS法
取试样的幼苗或叶片约 200 mg,或取种子充分磨碎后移入 2 .0 mL离心管 ,加入 100 μL氯仿后研磨 ,再加入 300 μLSDS提取液 ,混匀后在 10 000 r/min离心 2 min. 吸取上清液 ,转移至预先装有 300 μL异丙醇和 300 μL 5 mol/L氯化钠溶液的 1 .5 mL离心管中 . 待成团后 ,挑出 DNA,经 70%乙醇洗涤后 ,加入 200 μLTE缓冲液 ,充分溶解后供备用 .
注 : 以上为推荐的 DNA提取方法 ,DNA质量能够满足基 因 分 型 平 台 检 测 要 求 的 其 他 提 取 方 法 均 适 用 . 提 取 的 DNA在 260 nm 与 280 nm 处的吸光度比值介于 1 .7 ~ 2 .0 ,在 260 nm 与 230 nm 的吸光度比值大于 2 .0 .
10 .3 SNP分型
10 .3 .1 DNA 扩增、片段化、沉淀具体步骤如下 :
a) 变性 :DNA模板 8 .7 μL,每孔加 8 .7 μL的变性试剂 ,室温放置 10 min;
b) 中和 :每孔加 56 .6 μL中和试剂 ;
c) 扩增 :每孔加 100 .1 μL扩增试剂 ,37 ℃杂交炉中孵育(23±1)h;
d) 终止扩增反应 : 将样品板从 37 ℃杂交炉中取出 ,放入 65 ℃杂交炉 ,孵育 20 min,然后放入 37 ℃杂交炉 ,孵育 45 min;
e) 片段化 :每孔加 24 .8 μL片段化预混试剂 ,37 ℃孵育 30 min;
f) 片段化终止反应 :每孔加 8 .3 μL终止液 ;
)) 试:用.43的,置,式芯片 ,试剂用量需调整 .
10 .3 .2 干燥、重悬及质控
具体步骤如下 :
a) 干燥 :4 ℃离心 ,3 200×g 离心 40 min,弃上清液 ,烘干 ;
b) 重悬 :50 μL杂交混合液 ,振荡溶解 15 min;
c) 质控 :用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计进行定性及定量检测 ,条带大小为 25 bp~ 125 bp、浓度 ≥ 500 ng/μL,合格后方可进行后续试验 .
10 .3 .3 杂交、芯片扫描
具体步骤如下 :
a) 杂交 :启动芯片扫描仪及其软件 ,上传样品信息 ,待杂交样品变性 . 变性程序为 :95 ℃ 10 min,48 ℃ 3 min,48 ℃ 保存 . 变性后将样品转移至杂交板 ,放入芯片扫描仪指定位置 ,48 ℃杂交 23 .5 h.
b) 清洗 、染色 :根据芯片扫描仪系统提示 ,将清洗液与染色试剂放入对应位置 ,扫描仪自动清洗 .
c) 扫描 :清洗染色结束后芯片扫描仪自动进行荧光信号扫描 .
d) 数据分析 :采用软件对扫描出来的数据进行质量控制及基因分型分析 ,参数设置为 DQC≥0 .82 、 QC≥95% .
1 1 结果计算
1 1 .1 数据记录
数据记录方式用 SNP位点碱基符号表示基因型 ,如 AA、TT、CC或 GG,缺失数据记录为?? . 在进行SNP基因型数据记录时 ,为实现跨实验室的数据整合和标准化管理 ,基于多实验室或多 SNP分型平台产生的数据 ,应使用已知基因分型的参照样品进行校正 . 单个样品的位点缺失率应不高于 10% .
注 :推荐玉米自交系京 724 和京 92 作为参照样品 .
1 1 .2 数据比对
将送检样品每个位点的等位变异数据逐一比对 ,按照位点相同 、差异 、数据缺失 、无法判定 4 种情况记录每个位点的结果 .
1 1 .3 遗传相似度计算
遗传相似度按公式(1)计算 .
CS× 100 … … … … … … … … … … … … … … … … … (1)
式中 :
GS — 送检品种样品与对照品种样品的遗传相似度 ,单位为百分号(%) ;
S — 送检品种样品与对照品种样品中均检出的但基因型无任何差异的标记位点数目 ;
C — 送检品种样品与对照品种样品中均检出的标记位点数目 .
12 结果判定与表述
12 .1 品种鉴定判定规则
当送检品种样品与对照品种样品的遗传相似度小于等于 95 .00%时 ,判定为 “不同品种 ”;
当送检品种样品与对照品种样品的遗传相似度大于 95 .00%时 ,判定为 “疑同品种 ”.
12 .2 实质性派生关系判定规则
当送检品种样品与对照品种样品的遗传相似度小于等于 92 .00%时 ,判定为 “非实质性派生品种 ”;
当送检品种样品与对照品种样品的遗传相似度大于 92 .00%时 ,判定为 “疑似实质性派生品种 ”.
注 1 :实质性派生关系判定只针对玉米自交系品种 ,不涉及玉米杂交种 .
注 2 :对于遗传相似度大于 92 .00%的情况 ,必要时可综合 GB/T 19557 .24 的特异性鉴定结果 、转基因品种的转化体鉴
定结果 、育种记录档案等信息 ,进一步甄别二者是存在实质性派生关系还是为同一品种 .
12 .3 结果表述
利用 SNP标记法 ,送检样品 与对照样品 (或数据库中 品种)采用 检测平台进行检测 , 比对位点数为 ,遗传相似度为 . 判定为 .
附 录 A
(规范性)
主要仪器设备及试剂
A.1 主要仪器设备
A.1 .1 高速冷冻离心机 :转速不低于 12 000 r/min。
A.1 .2 微量移液工作站或微量移液器。
A.1 .3 水浴锅或干式恒温金属浴 :20 ℃ ~ 100 ℃ 。
A.1 .4 紫外分光光度计 :波长定点扫描 230 nm、260 nm 和 280 nm。
A.1 .5 组织研磨仪。
A.1 .6 分析天平 :感量为 0 .01 g。
A.1 .7 pH 计 。
A.1 .8 涡旋混合器。
A.1 .9 高压灭菌锅。
A.1 .10 芯片扫描仪及其配套相关仪器设备(能检测 5 万个及以上位点)。
A.1 .1 1 杂交炉(20 ℃ ~ 100 ℃) 。
A.1 .12 板式离心机(4 ℃ ,3 500 g) 。
A.1 .13 涡旋混合器。
A.1 .14 微量移液器。
A.1 .15 摇床。
A.1 .16 PCR仪(使用 96 孔或 384 孔 PCR板) 。
A.2 主要试剂
除非另有说明 ,在分析中均使用分析纯试剂。
A.2 .1 CTAB[C16 H33 (CH3) 3 NBr,CAS号 :57__09__0] 。
A.2 .2 三氯甲烷(CHCl3 ,CAS号 :67__66__3) 。
A.2 .3 异戊醇(C5 H12 O,CAS号 :123__51__3) 。
A.2 .4 异丙醇(C3 H8 O,CAS号 :67__63__0) 。
A.2 .5 乙二胺四乙酸二钠(C10 H14 N2 Na2 O8 ,CAS号 :139__33__3) 。 A.2 .6 三羟甲基氨基甲烷[NH2 C(CH2 OH) 3 ,CAS号 :77__86__1]。 A.2 .7 氢氧化钠(NaOH ,CAS号 :1310__73__2) 。
A.2 .8 氯化钠(NaCl,CAS号 :7647__14__5) 。
A.2 .9 无水乙醇(CH3 CH2 OH ,CAS号 :64__17__5) 。
A.2 .10 盐酸(HCl,CAS号 :7647__01__0) 。
A.2 .1 1 β_巯基乙醇(C2 H6 OS, CAS号 :60__24__2) 。
A.2 .12 SDS(C12 H25 NaSO4 , CAS号 : 151__21__3) 。
A.2 .13 RNaseA(CAS号 :9001__99__4) 。
A.2 .14 定制 SNP芯片及配套试剂。
附 录 B (规范性)溶液配制
试剂配制用水应符合 GB/T 6682 的要求。
B.1 0.5 mol/L EDTA 溶液
称取 186 .1 g 乙二胺四乙酸二钠(C10 H14 N2 Na2 O8)溶于 800 mL水中 ,加固体 NaOH 调 pH 至 8 .0 ,加水定容至 1 000 mL,121 ℃高压灭菌 20 min。
B.2 1 mol/L TrisG HCl溶液
称取 60 .55 gTris碱 溶 于 适 量 水 中 , 加 HCl调 pH 至 8 .0 , 加 水 定 容 至 500 mL, 121 ℃高 压 灭 菌20 min。
B.3 5 mol/L NaCl溶液
称取 146 .1 g 固体 NaCl,加水定容至 500 mL,121 ℃高压灭菌 20 min。
B.4 CTAB 提取液
5 mol/L NaCl 280 mL、β_巯 基 乙 醇 (C2 H6 OS) 10 mL、CTAB 20 g、1 mol/L Tris_HCl 100 mL、 0 .5 mol/LEDTA 40 mL,加水定容至 1 000 mL,4 °C储存。
B.5 SDS提取液
1 mol/LTris_HCl50 mL、0 .5 mol/L EDTA 50 mL、5 mol/L NaCl50 mL和 SDS 7 .5 g混合 ,加水定容至 500 mL。
B.6 TE 缓冲液
1 mol/LTris_HCl5 mL和 0 .5 mol/LEDTA 1 mL,加 HCl调 pH 至 8 .0 ,加水定容至 500 mL。
附 录 C
(规范性)
SNP位点名单及相关信息
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