中华人民共和国农业行业标准
NY/T 4916—2025
莲品种及其实质性派生品种鉴定
MNP标记法
Identification of lotus varieties and their essentially derived varieties—
MNP marker method
2025-12-09 发布
2026-05-01 实施
中华人民共和国农业农村部 发 布
前 言
本文件按照 GB/T 1 .1—2020« 标准化工作导则 第 1 部分 :标准化文件的结构和起草规则»的规定起草 .
请注意本文件的某些内容可能涉及专利 . 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 .
本文件由农业农村部种业管理司提出 .
本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC 277)归 口 .
本文件起草单位 :武汉市农业科学院 、岳阳市农业科学研究院 、农业农村部科技发展中心 、山西农业大学 、江汉大学 .
本文件主要起草人 :孙亚林 、王直新 、刘琪龙 、韩瑞玺 、柯卫东 、焦雄飞 、彭海 、朱红莲 、彭长城 、李甜甜 、周俊飞 .
莲品种及其实质性派生品种鉴定
MNP标记法
1 范围
本文件规定了利用多核苷酸多态性(Multiple Nucleotide Polymorphism , MNP)标记法进行莲(NeG lumbonucifera Gaertn.) 品种鉴定及其实质性派生品种鉴定的术语和定义 、原理 、试剂和材料 、仪器设备 、操作程序 、质量控制 、数据分析 、结果判定与表述 .
本文件适用于莲品种及其实质性派生品种的鉴定 .
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 . 其中 ,注日期的引用文件 ,仅该日期对应的版 本 适 用 于 本 文 件 ; 不 注 日 期 的 引 用 文 件 , 其 最 新 版 本(包 括 所 有 的 修 改 单)适 用 于 本文件 .
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 38551 植物品种鉴定 MNP标记法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件 .
3 .1
多核苷酸多态性 multiplenucleotidepolymorphism ,MNP
在一段核苷酸序列中 , 由一个或多个核苷酸变异引起的序列多态性 .
[来源 :GB/T 38551—2020 ,3 .1 ,有修改]
3 .2
实质性派生品种 essentiallyderived variety,EDV
由原始品种实质性派生 ,或者由该原始品种的实质性派生品种派生出来的品种 ,与原始品种有明显区别 ,并且除派生引起的性状差异外 ,在表达由原始品种基因型或者基因型组合产生的基本性状方面与原始品种相同 .
[来源 : 中华人民共和国种子法 ,第九十条第十款] 3 .3
平均覆盖倍数 averagecoverage
在基因组上比对到所有标记位点上的所有测序片段的总数与标记位点总数的比值 .
[来源 :GB/T 38551—2020 ,3 .4 ,有修改] 3 .4
检出标记位点 detected markers
至少有一个等位基因型且有 20 条及以上测序片段支持的标记位点 .
[来源 :GB/T 38551—2020 ,3 .5 ,有修改]
4 原理
莲品种的基因组中存在着能够世代稳定遗传的 MNP位点 ,不同莲品种间同一组 MNP位点的序列上可能存在差异 ,这种差异可通过基于 PCR、二代高通量测序以及生物信息学方法进行检测 ,进而区分不同的品种 .
5 试剂和材料
除非另有规定 ,仅使用分析纯试剂 ,实验用水符合 GB/T 6682 中规定的一级水的要求 . 5 .1 多重 PCR扩增与文库构建试剂盒
应匹配 MNP标记和标记检测引物 , 以及高通量测序试剂盒 .
5 .2 高通量测序试剂盒
应匹配高通量测序仪 .
5 .3 MNP标记和标记检测引物
应符合附录 A 的要求 .
6 仪器设备
6 .1 离心机
最大转速度不小于 12 000 r/min.
6 .2 电泳仪
6 .3 PCR扩增仪
6 .4 高通量测序仪
测序读长不低于 300 bp.
6 .5 计算机服务器
7 操作程序
7 .1 样品准备
送检样品不少于 5 个个体 ,为幼苗 、叶片 、茎尖组织或器官 . 试验样品不少于 3 个个体 . 样品可以混合检测 ,必要时进行个体检测 .
7 .2 DNA提取
7 .2 .1 CTAB法
将混合样品在液氮中 研 磨 至 粉 末 , 迅 速 取 约 200 mg粉 末 置 于 2 .0 mL 离 心 管 中 ; 每 管 加 入 600μL 65 ℃预热的 CTAB提取液 ,充分混合 ,65 ℃水浴 45 min~ 60 min,每间隔 15 min轻缓颠倒混匀 ,水浴后12 000 r/min离心 10 min. 吸取上清液转移至新的离心管中 ,每管加入与提取液等体积的三氯甲烷和异戊醇 ,轻缓混匀后静置 10 min;12 000 r/min离心 10 min后吸取上清液至新的离心管中 ,加入等体积预冷
,液,0, i,,i分in溶. 上 ,
浓度1质:,方. T,其B他. DNA提取方法均适用于本标准 . DNA
溶液的紫外吸光度 OD260 与 OD280 的比值宜介于 1 .7 ~ 2 .0 .
注 2 :三氯甲烷和异戊醇混合液中三氯甲烷与异戊醇的体积比为 24 ∶ 1 .
7 .2 .2 试剂盒提取法(仲裁法)
利用核酸提取试剂盒提取待测样品 DNA. 提取的 DNA 在 260 nm 与 230 nm 处的吸光度值的比值大于 2 .0 ,260 nm 与 280 nm 处的吸光度比值介于 1 . 7 ~ 1 .9 . 方法见附录 C 中的 C.2 .
7 .3 多重 PCR扩增与文库构建
按多重 PCR扩增与文库构建试剂盒的说明书进行 DNA 质控 、多重 PCR 扩增 、文库构建与纯化 . 其中 ,多重 PCR 的扩增循环数不高于 20 次 . 方法见 C.3 .
7 .4 高通量测序
按高通量测序试剂盒和高通量测序仪的操作说明 ,对 7 .3 中获得的高通量测序文库进行高通量测序 .
高通量测序时标记位点的平 均 覆 盖 倍 数 宜 设 置 为 700 倍 以 上 , 测 序 片 段 总 读 长 不 小 于 300 bp. 方 法 见
C.4 。
8 质量控制
8 .1 环境
样品准备 、DNA提取 、多重 PCR扩增 、文库构建和高通量测序宜在规定的区域或相互隔离的区域按单一方向进行操作 ,不同区域的仪器设备需专用。
8 .2 测序数据
8 .2 .1 高通量测序原始数据质量应满足所采用的高通量测序仪的操作手册中所规定的测序质量要求。
8 .2 .2 将样品的测序数据比对到参考基因组的标记位点上 ,统计第一次检测的标记位点的平均覆盖倍数C1 。
8 .2 .3 当 C1 小于 500 时 ,判定样品的测序数据量不足 ,从 7 .4 或之前的步骤开始重新实验至检测标记位点的平均覆盖倍数 C1 大于或等于 500 。
8 .2 .4 当 C1 大于或等于 500 时 ,进一步计算检出标记位点的比例 R1 。
R1 按公式(1)计算。
R1 = × 100 … … … … … … … … … … … … … … … … … (1)
式中 :
R1 — 样品检出标记位点的比例 ,单位为百分号(%) ;
T1 — 样品检出标记位点的数目 ;
T — 样品检测标记位点的数目。
8 .2 .5 当 R1 大于或等于 95%时 ,判定测序数据合格 ;否则 ,从 7 .2 或之前的步骤重新实验至第二次检出的标记位点的平均覆盖倍数 C2 大于或等于 500 。
8 .2 .6 当 C2 大于或等于 500 时 ,进一步计算第一次和第二次共同检出的标记位点的比例 R2 。
R2 按公式(2)计算。
R2 = × 100 … … … … … … … … … … … … … … … (2)
式中 :
R2 — 第一次和第二次共同检出的标记位点的比例 ,单位为百分号(%) ;
T12 — 第一次和第二次共同检出标记位点的数目 ;
T11 — 第一次检出标记位点的数目 ;
T2 — 第二次检出标记位点的数目。
8 .2 .7 当 R2 大于或等于 95%时 ,判定测序数据合格。
注 : 附录 B提供了一个操作案例 ,其他满足 DNA提取 、文库制备和高通量测序的试剂 、仪器设备均可。
9 数据分析
9 .1 测序数据比对与记录
9 .1 .1 将测序数据同源比对到参考基因组上的每个 MNP标记位点上。
9 .1 .2 位点的基因型指该位点的所有检出等位基因型 ,其中 ,检出等位基因型指从该标记第一个到最后一个碱基构成的检出 DNA 片段 ,不同检出等位基因型用 “/”隔开。 位点的基因型记录实例见 C.8 。
9 .2 遗传相似度计算
遗传相似度按公式(3)计算。
式中 :
GS — 待测品种与对照品种的遗传相似度 ,单位为百分号(%) ;
nij — 待测品种与对照品种中均检出的但基因型无任何差异的标记位点的数目 ;
Nij — 待测品种与对照品种中均检出标记位点的数目 .
10 结果判定与表述
10 .1 品种鉴定
10 .1 .1 当待测品种与对照品种的 GS小于 96 .00%时 ,判定为“不同品种 ”.
10 .1 .2 当待测品种与对照品种的 GS大于或等于 96 .00%时 ,判定为“疑同品种 ”.
10 .2 实质性派生品种判定
10 .2 .1 当待测品种与对照品种的 GS小于 90 .00%时 ,判定为“非实质性派生品种 ”.
10 .2 .2 当待测品种与对照品种的 GS大于或等于 90 .00%时 ,判定为“疑似实质性派生品种 ”;
10 .3 结果表述
待测品种 与 对 照 品 种 比 较 位 点 数 为 , 差 异 位 点 数 为 , 遗 传 相 似 度 为 ,判定为 .
示例 1 :待测品种 A与对照品种 B 比较位点数为 506 ,差异位点数为 5 ,遗传相似度为 99 .01% ,判定为疑同品种 .
示例 2 :待测品种 A与对照品种 B 比较位点数为 504 ,差异位点数为 56 ,遗传相似度为 88 .89% ,判定为非实 质 性 派 生品种 .
注 :结果表述也可采用表格形式 ,但需完整包含上述内容 .
附 录 A
(规范性)
MNP标记和标记检测引物
MNP标记编号 、染色体位置 、引物序列 、变异类型 、参照品种等信息见表 A.1 。
表 A.1 MNP标记和标记检测引物信息
表 A.1 (续)
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NY/T 4916—2025
附 录 B (资料性)
DNA提取溶液配制
B.1 0 .5 mol/LEDTA溶液
称取 186 .1 g Na2 EDTA ●2H2 O 溶于 800 mL水中 ,充分搅拌溶解 ,加 NaOH 调 pH 至 8 .0 ,加水定
容至 1 000 mL,121 ℃高压灭菌 20 min。
B.2 0.5 mol/L HCl溶液
量取 25 mL浓盐酸(质量分数为 36% ~ 38%) ,加水定容至 500 mL。
B.3 1 mol/L NaOH 溶液
称取 40 .0 g NaOH 溶于 800 mL水中 ,充分搅拌溶解 ,加水定容至 1 000 mL。
B.4 1 mol/L TrisG HCl溶液
称 取 60 .55 g三羟甲基氨基甲烷溶于 400 mL水中 ,加 HCl调 pH 至 8 .0 ,加水定容至 500 mL,121 ℃高压灭菌 20 min。
B.5 CTAB提取液
称取 20 .0 g CTAB、81 .7 g NaCl置 于 1 000 mL 烧 杯 中 , 量 取 100 mL 1 mol/L Tris_HCl溶 液 和40 mL 0 .5 mol/LEDTA溶液倒入烧杯中 ,加 700 mL水 ,充分搅拌溶解 ,加水定容至 1 000 mL,121 ℃高压灭菌 20 min。
B.6 TE 缓冲液
量取 5 mL 1 mol/LTris_HCl溶液和 1 mL0 .5 mol/LEDTA溶液 ,加水定容至 500 mL,121 ℃高压灭菌 20 min,4 ℃保存。
(资料性)
品种鉴定流程示例
C.1 样品准备
照样来“”家,“1”(武汉) . 待测样品名称“贵三莲 ”,实验编号“LO0444G 11 ”;对
C.2 DNA提取
采用某公司生产的新型植物基因组 DNA提取试剂盒提取莲叶片 DNA,具体步骤如下 :
a) 向 装 有 叶 片 的 离 心 管 中 加 入 液 氮 充 分 碾 磨 后 , 加 入 400 μL缓 冲 液 LP1 和 6 μL RNase A (10 mg/mL) ,涡旋振荡 1 min,室温放置 10 min.
b) 加入 130 μL缓冲液 LP2 ,充分混匀 ,涡旋振荡 1 min.
c) 12 000 r/min离心 5 min,将上清液移至新的离心管中 .
d) 加入 1 .5 倍体积的缓冲液 LP3 (使用前请先检查是否已加入无水乙醇) ,立即充分振荡混匀 15 s,此时可能会出现絮状沉淀 .
e) 将上一步所得溶液和絮状沉淀加入一个吸附柱 CB3 中 (吸附柱放入收集管中) , 12 000 r/min离心 30 s,倒掉废液 , 吸附柱 CB3 放入收集管中 .
f) 向吸附柱 CB3 中加入 600 μL漂洗液 PW (使用前请先检查是否已加入无水乙醇) , 12 000 r/min离心 30 s,倒掉废液 ,将吸附柱 CB3 放入收集管中 .
g) 重复操作步骤 f) .
h) 将吸附柱 CB3 放回收集管中 ,12 000 r/min离心 2 min,倒掉废液 . 将吸附柱 CB3 室温放置数分钟 ,彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液 .
i) 将吸附柱 CB3 转入一个干净的离心管中 , 向吸附膜的中间部分悬空滴加 50 μL洗脱缓冲液 TE,
温,Ni .min,12 000 r/min离心 2 min,将溶液收集到离心管中 . 产物放于- 20℃冰
j) DNA质检 . 用 分 光 光 度 计 测 定 并 计 算 LO0444G 11 和 LO0456G 11 的 DNA 溶 液 在 260 nm 与
2 .02 和 2 .04;取 4 μL DNA 在 1%的 琼 脂 糖 凝 胶 上 电 泳 , 检 测 DNA 条 带 是 否 完 整 , 结 果 如 图
.n;N/bit荧光定量仪测定 LO0444G 11 和 LO0456G 11 的 DNA浓度 ,分别
注 :最左边条带为某公司生产的分子量标准 ,其由下至上片段大小分别为 564 bp、2 027 bp、2 322 bp、4 361 bp、6 557 bp、9 416 bp和 23 130 bp.
C.3 多重 PCR扩增与文库构建
C.3 .1 多重 PCR扩增
采用某公司生产的多重扩增试剂盒进行多重 PCR扩增与文库构建 ,该试剂盒匹配后序步骤中某公司的测序平台 ,需自备 80%乙醇 ,其余试剂均为试剂盒提供 .
下面G PCR扩增与文库构建实验流程完全一样 , 因此 , 除特别说明 ,
图 C.1 LO0444 -1 1 和 LO0456 -1 1 的 DNA 电泳图
a) 配制多重 PCR扩增体系 . 在 PCR 管中加入 4 μL表 A.1 中的多重 PCR 引物混合物(每条引物
为μ.μ,l/)匀、4 μL样品 LO0444G 11 的基因组 DNA、10 μLGenoPlexs3 ×T MasterMix
b) 多重 PCR扩增反应 . 多重 PCR扩增程序 :95 ℃ ,3 min; (95 ℃ ,20 s,60 ℃ ,4 min) × 15 个循环 ;
72 ℃ ,4 min. 反应结束后 ,获得多重 PCR扩增产物 .
C.3 .2 多重 PCR扩增产物纯化
a) 向 C.3 .1 中获得的多重 PCR扩增产物中加入 12 μL (C.3 .1 中获得的 30 μL多重 PCR 扩增产物的 0 .4倍体积) GenoPrep DNA Clean Beads,振荡混匀后 ,室温静置 5 min.
b) 将 PCR管置于磁力架上吸附磁珠 ,直至溶液澄清 .
c) 用移液器吸取上清液至新的 1 .5 mL离心管中 ,避免吸到磁珠 .
d) 向上清液中加入 18 μL (C.3 .1 中获得的 30 μL多重 PCR扩增产物的 0 .6 倍体积)的 GenoPrep DNA Clean Beads,振荡混匀后 ,室温静置 5 min.
e) 用磁力架吸附磁珠 ,直至溶液澄清 . 用移液器小心吸取上清液 ,弃上清 , 留磁珠 .
f) 加入 40 μLGenoPlexsBW10 Buffer,悬浮磁珠 ,室温静置 5 min. 用磁力架吸附磁珠 ,直至溶液澄清 . 用移液器小心吸取上清液 ,弃上清液 , 留磁珠 .
g) 加入 100 μL80%乙醇(现用现配) ,用移液器小心去除上清液 ,避免吸到磁珠 .
h) 室温放置 ,直至乙醇挥发干净 ,避免过干 ,获得纯化的多重 PCR扩增产物 .
C.3 .3 高通量测序文库构建
a) 向 C.3 .2 中获得的纯化的多重 PCR扩增产物中 ,加入 10 μLGenoPlexs3 ×T MasterMix、2 μL浓度为 5 μmol/L的 P5 primer、2 μL浓度为 5 μmol/L的 P7 barcodeprimer(引物中包含样品条
b) 制,G,).:95 ℃ ,3 min; (95 ℃ , 15
s;58 ℃ ,15 s;70 ℃ ,30 s) × 8 个循环 ;72 ℃ ,5min.
c) 反应结束后 , 即构建好 30μL样品 LO0444G 11 的高通量测序文库 .
C.3 .4 高通量测序文库纯化
a) 向 C.3 .3 中获得的高通量测序文库中加 24 μL (C.3 .3 中获得的 30 μL高通量测序文库的 0 .8倍体积) GenoPrep DNA Clean Beads,振荡混匀 ,室温静置 5 min.
b) 用磁力架吸附磁珠 ,直至溶液澄清 . 用移液器小心吸取上清液 ,弃上清 , 留磁珠 .
c) 加入 40 μLGenoPlexsBW07 Buffer,涡旋均匀 .
d) 用磁力架吸附磁珠 ,直至溶液澄清 . 用移液器小心去除上清液 ,避免吸到磁珠 .
e) 加入 100 μL80%乙醇(现用现配) ,用移液器小心去除上清液 . 室温放置 ,直至乙醇挥发干净 .
f) 加入 35 μL 10 mmol/L TrisG HCl(pH = 8 .0) ,充分悬浮磁珠 ,室温静置 5 min. 将离心管置于
获得的纯化高通量测序文库直接用于后续实验或置于- 20 ℃保存 .
g) 高通量测序文库质检。 取 1 μL纯化的高通量测序文库用 Qubit荧光定量仪检测获得 LO0444__
扩增条带和引物二聚体残留(图 C.2) ,质量合格。
图 C.2 样品 LO0444-1 1 和样品 LO0456-1 1 的高通量测序文库电泳图
注 :最左边条带为某公司生产的分子量标准 ,其由下至上分子量大小分别为 100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp和600 bp。
h) 高通量测序文库混合。 分别取样品 LO0444__11 和样品 LO0456__11 各 100 ng,振荡混匀并离心 ,
获得上机混合测序文库。
C.4 高通量测序
C.4 .1 上机混合测序文库变性
对 C.3 中获得的上机混合测序文库进行变性。
a) 采用 Qubit荧光定量仪测定上机混合测序文库的浓度为 32 .6 ng/μL。该试剂盒推荐文库投入
文库的质量(ng) = DNA 度 (bfi) X 660ng , 其 中 , DNA 主 片 段 长 度 按 400 bp计 算 ,
1 pmol上机混合测序文库对应的质量为 264 ng,所需体积为 264/32 .6 = 8 .1μL。
C.4 .2 文库变性产物单链环化
按某公司生产的环化试剂盒的操作手册对文库进行环化。
a) 在冰上配制 12 .1 μL的单链环化反应液 ,其中包含 11 .6 μL的 SplintBuffer和 0 .5 μL的 DNA Rapid Ligase。
b) 向上述单链环化反应液中加入 C.4.1 中获得的文库变性产物 ,涡旋振荡 6 次 ,每次 3 s,瞬时离心将反应液收集至管底后 ,37 ℃保温 30 min,获得单链环化产物。
C.4 .3 酶切消化
对环化产物进行酶切 ,执行以下步骤。
a) 在冰上配制 4.0 μL的酶切消化反应液 ,其中包含 1 .4 μL 的 Digestion Buffer和 2 .6 μL 的 Di_
gestion Enzyme.
b) 向酶切消化反应液中加入 C.4 .2 中获得的单链环化产物后 ,涡旋震荡 6 次 ,每次 3 s,瞬时离心将反应液收集至管底 ,37 ℃反应 30 min.
c) 反应结束后 ,加入 7 .5 μLDigestion StopBuffer,涡旋振荡 6 次 ,每次 3 s,瞬时离心将反应液收集至管底 ,获得酶切消化后的单链环化产物 .
d) 将酶切消化后的单链环化产物转移到新的 1 .5 mL离心管中 .
C.4 .4 单链环化产物纯化
对单链环化产物进行纯化 ,执行以下步骤 .
a) 提前 30 min取出 DNA Clean Beads 置于室温 ,使用前充分振荡混匀 .
b) 吸取 170 μL DNA Clean Beads至 C.4 .3 获得的酶切消化后的单链环化产物中 ,用移液器轻轻吹打至少 10 次至完全混匀 ,最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠打入 1 .5 mL离心管中 .
c) 室温孵育 10 min.
d) 瞬时离心 ,将 1 .5 mL离心管置于磁力架 ,静置 2 min~ 5 min至液体澄清 ,用移液器小心吸取并丢弃上清液 .
e) 保持 1 .5 mL 离心管置于磁力架上 ,加入 500 μL新鲜配制的 80%乙醇漂洗磁珠及管壁 ,小心吸取并弃上清液 .
f) 重复步骤(e) ,尽量吸干管内液体 .
g) 保持 1 .5 mL离心管置于磁力架上 ,打开 1 .5 mL离心管管盖 ,室温干燥 ,直至磁珠表面无反光 、无开裂 .
h) 将 1 .5 mL离心管从磁力架上取下 ,加入 22 μLTE Buffer进行 DNA洗脱 ,用移液器轻轻吹打至少 10 次至完全混匀 .
i) 室温下溶解 10 min.
j) 瞬时离心 ,将 1 .5 mL EP管置于磁力架上 ,静置 2 min~ 5 min至液体澄清 ,将 20 μL上清液转移
k) .L , 化its.Dsit冰(月)浓.
度为 2 .2 ng/μL,按如下公式进行换算环化产物的 fmol浓度为 16 .7 fmol/μL.
C fmol/μL
C.4 .5 高通量测序
采用某公司生产的高通量测序试剂盒 ,对环化产物进行高通量测序 .
a) 从某公司生产的高通量测序试剂盒中取出 DNB制备缓冲液 、DNB聚合酶混合液 Ⅰ 、TE 缓冲液和 DNB终止缓冲液 ,置于冰盒上约 0 .5 h,待试剂融化后 ,使用涡旋振荡器振荡混匀 5 s后 ,短暂离心置于冰盒上备用 .
b) 取 0 .2 mL PCR 管 ,在冰上配制 40 μL的反应混合液体系 ,其中包括 2 .4μL的环化文库 ssDNA(
环化文库 ssDNA= 环 度 = = 2 .4μL) 、17 .6μL的 TE 缓冲液和 20 μL
的 DNB 制备缓冲液 .
c) 将 b)中获得的混合液体系涡旋振荡器振荡混匀 ,离心 5 s,置于 PCR 仪中 95 ℃ , 1 min; 65 ℃ , 1 min、40 ℃ ,1 min和 4 ℃ ,10 min.
d) 取出 DNB聚合酶混合液 Ⅱ (LC)置于冰盒上 ,短暂离心 5 s,置于冰盒上备用[请勿将 DNB聚合酶混合液 Ⅱ (LC)置于室温 ,请勿长时间触碰管壁] .
e) 当 c) 中 PCR 仪达到 4 ℃后取出 PCR管 ,离心 5 s;在冰上加入 40 μL DNB 聚合酶混合液 Ⅰ 和
4 μLDNB 聚合酶混合液 Ⅱ (LC) ,振荡混匀 ,离心 5 s,立即置于 PCR 仪中 ,在 35 ℃热盖条件下30 ℃ ,25 min和 4 ℃ ,10 min;PCR仪降温至 4 ℃后 ,立即加入 20 μLDNB终止缓冲液 ,用阔 口吸头缓慢地吹打混匀 5 次 ~ 8 次 (切勿振荡或剧烈吹打) ,获得制备好的 DNA纳米球(DNB) .
f) DNB浓度测定。 采用 Qubit® ssDNA Assay Kit在 Qubit荧光定量仪上检测制备好的 DNB 的
h) 在 0 .5 mL冻存管中配制 DNB加载体系 :50 μL的 DNB加载缓冲液 Ⅰ 、50 μL的 DNB加载缓冲液 Ⅱ 、1μL的 DNB 聚合酶混合液 Ⅱ (LC)和 100 μL(浓度大于 8 ng/μL)制备好的 DNA 纳米球(DNB) ;用阔口吸头缓慢混匀 5 次 ~ 8 次 (切勿离心 、振荡及剧烈吹打) ,4 ℃保存备用。
i) 准备测序试剂槽。 取出测序试剂槽 ,常温水浴解冻 3 h~4 h(或者提前 1 d将其置于 2 ℃ ~ 8 ℃冰箱解冻)后 ,置于 2 ℃ ~ 8 ℃冰箱备用 ;使用前颠倒混匀试剂槽 3 次 ,然后将试剂槽置于正前方 ,前后左右剧烈晃动 10 次 ~ 20 次 ,直至试剂中无肉眼可见的分层 ,尤其是该测序试剂槽的 17号试剂和 18 号试剂 ;打开试剂槽盖板 ,使用无尘纸擦净冷凝水。
j) 提前 1 h取出 dNTPs混合液 Ⅲ和 dNTPs混合液 Ⅱ ,室温融化后置于冰上或 4 ℃备用 ;加样前需使用涡旋振荡器振荡 5 s混匀 ,短暂离心(离心到底部即可)后使用 ;使用前取出 DNA 聚合酶混合液 ,置于冰上或 4℃备用 ,加样前需颠倒混匀 4 次 ~ 6 次 。
k) 使用洁净的 1 mL枪头在测序试剂槽的 1 号和 2 号孔边缘位置轻轻戳出一个直径约 2 cm 的加样孔位 ;在 1 号孔位中加入 0 .96 mL dNTPs混合液 Ⅲ和 0 .96 mL DNA 聚合酶混合液 ;在 2 号孔位中加入 2 .04 mL dNTPs混合液 Ⅱ 和 1 .02 mL DNA 聚合酶混合液 ;使用配套的透明封口膜将 1 号和 2 号加样孔封住(切勿盖住孔位中心位置 ,避免影响试剂针下降)。
l) 测序试剂槽水平放置在桌面上 ,双手握住两侧 ,顺时针摇晃 10 次 ~ 20 次 ,再逆时针摇晃 10 次 ~ 20 次 ,其间要确保肉眼可见旋涡 ,直至该试剂槽中 1 号孔位中的试剂上下层颜色均匀一致 , 以保证试剂充分混匀。
m) 使用枪头戳破 15 号孔的封口膜 ;用 200 μL移液器移取 200 μL MDA 聚合酶混合液加入 MDA试剂的试剂管中 ;颠倒混匀 4 次 ~ 6 次 ,使其充分混匀 ,再将混匀液加入 15 号孔中 ,加入时确保管底部无气泡 ,至此即完成测序试剂槽上机前的准备工作。
n) 上机测序。 从 - 20 ℃冰箱中取出载片包装彩盒 ,将载片从中取出 ,拆开真空包装袋 ; 打开载片舱
出 ;用空气罐吹净载片平台和载片背面的灰尘(如果平台表面有可见结晶 ,需要用润湿的无尘纸
轻轻擦拭) ,按下载片吸附按钮 ,取出新的载片 ,两孔位置在左侧 ,一孔位置在右侧 ,标签位置靠
右 ,双手握住载片两端 ;载片孔位对应定位柱放置 ,保持载片空位内壁与定位柱贴合 ,将载片边框
左右两边同时按下 ,使载片吸附在平台上 ,确保载片可以牢固吸附 ,关闭载片舱门。
o) 打开试剂舱舱门 ,按照试剂槽盖板指示方向 ,把准备好的测序试剂槽轻轻推进试剂舱 ,直到推到底部并确认测序试剂槽完全放入 ;放入要加载的 DNB冻存管 ,关闭试剂舱舱门。
p) 在计算机软件界面上点击 “测序 ”,进入测序参数设置界面 ,输入 DNB编号 ,选择测序方案 “FCL PE150 ”,点击 “下一步 ”,将光标放置在 “试剂槽 ID”文本框 ,打开试剂舱舱门 ,使用条码扫描枪扫描测序试剂槽条码录入试剂槽信息 ,关闭试剂舱舱门 ;把光标移至 “载片 ID”后面的文本框 ,打开载片舱舱门 ,扫描载片上的二维码录入载片信息 ;各项信息确认无误后 ,点击 “开始 ”;待测序完成后 ,点击 “完成 ”,并将测序数据拷贝至移动硬盘。
C.5 测序数据拆分
高通量测序仪根据样品条形码的序列 , 自动将测序数据拆分到样品 LO0456__11 和样品 LO0444__11 。
样品 LO0456__11 的 正 向 和 反 向 测 序 序 列 存 放 文 件 的 名 称 分 别 为 LO0456__11 _ 1 .fq.gz和 LO0456__11 _ 2 .fq.gz。
C.6 测序数据比对
莲参考基因组版本为 GCA_003033685 .1 。
数据比对软件为 Bowtie2(版本号 2 .1 .0,下载地址: https://bowtie_bio.sourceforge.net),需要该软件的索引构建模块 bowtie2__build和序列比对模块 bowtie2 。
在 Linux窗口中输入以下命令行 :bowtie2__build_fGCA_003033685 .1 .fastaGCA_003033685 .1 ,构建莲参考基因组索引。
在 Linux窗口中输入以下命令行 :bowtie2 – q – p 2 – xGCA_003033685 .1__1LO0456__11 _1 .fq.gz_
2 LO0456__11 _2 .fq.gz – SLO0456__11 .sam ,将样品 LO0456__11 的测序数据比对到莲参考基因组上。 其
中 ,参数 “_q”表 示 输 入 文 件 是 fastq 格 式 ; 参 数 “_p 2 ”表 示 采 用 2 个 线 程 作 比 对 ; 参 数 “_x GCA_
003033685 .1 .fasta”指定比对参考基因组序列 ;参数 “_1 LO0456__11 _ 1 .fq.gz_2 LO0456__11 _ 2 .fq.gz”指定
样品 LO0456__11 的测序结果文件 ;参数“– SLO0456__11 .sam”把比对结果输入 LO0456__11 .sam 文件中。
比对结果采用 SAM(The Sequence Alignment/ Map format,序列比对格式)格式保存。 SAM 文件
格式详细说明见 http://samtools.github.io/hts_specs/SAMv1 .pdf。
按类似方法 ,将样品 LO0444__11 的测序数据比对到莲参考基因组上。
C.7 测序数据质量控制
若测序片段比对到参考基因组上的位置与标记位点在参考基因组上的位置重合 ,则判定该测序片段属于该标记位点。
统计每个标记位点的测序片段的数目 ,作为该标记位点的覆盖倍数。 例如 ,样品 LO0456__11 的第 1
按上述方法 ,获得 LO0456__11 所有标记位点的覆盖倍数 ,计算 LO0456__11 标记位点的平均覆盖倍数C1 = (902+第 2 个标记位点覆盖倍数 +… +第 515 个标记位点的覆盖倍数)/515= 980 .31 倍 。
每个标记位点所有相同测序片段归为同一个等位基因型 ,统计该标记位点的每个等位基因型的测序
片段的数目。 例如 ,表 C.1 为样品 LO0456__11 在表 A.1 中的第 1 个 MNP标记位点的所有等位基因型序
列及其测序片段数目。
表 C.1 中第 1 个等位基因型的测序片段的数目为 804 条 ,≥ 20 条 ,判定样品 LO0456__11 的该标记位点为检出标记位点。 依次判定样品 LO0456__11 的所有标记位点是否为检出标记位点。
统计样品 LO0456__11 的所有检出标记位点数量为 501 个 ,计算检出标记位点的比例 R1 = 501/512=
由于 R1 ≥ 95% ,判定样品 LO0456__11 的检出标记位点的比例合格。
由于样品 LO0456__11 的标记位点的平均覆盖倍数和检出标记位点的比例均合格 ,判定样品 LO0456_ 11 的测序数据质量合格。
按同样方法 ,判定样品 LO0444__11 的测序数据质量合格。
表 C.1 样品 LO0456 -1 1 第 1 个 MNP标记位点测序片段统计结果
表 C.1 (续)
表 C.1 (续)
C.8 标记位点分型
将样品 LO0456__11 第 1 个标记位点的等位基因型的测序片段数目由高到低排列 ,其结果如表 C.1 所
示 。测序片段数目最多的等位基因型 , 即表 C.1 中序号为 1 的等位基因型称为主等位基因型 ,其他等位
基因型称为次等位基因型。
计算表 C.1 中序号为 2 的次等位基因型的测序片段数目与主等位基因型测序片段数目的比值为 51/
= 0 .06 。 由于该比值小于 0 .2 ,不太可能由杂株或者测序错误等原因造成 , 因此舍弃该次等位基因
获得的比值均小于等于 0 .2 , 因此均舍弃这些次等位基因型。
主等位基因型和所有保留的次等位基因组成样品 LO0456__11 第 1 个标记位点的基因型 ,记为 :AAG ATCACATTCTCACCTACAGAGAAAAGATTACAGAAGAGAGAAAACAGCTTCCAGTAGAACT GCGCTGATTTCTCCCTGCCGCCTCCTTCCAACCGCCGCCGCCATTGCCAGTGCATCTCCACGAC AATAGGAGTGATCAAGAATGGT/AAGATCACATTCTCACCTACAGAGAAAAGATTACAGAA GAGAGAAAACAGCTTCCAGTAGAACTGCGCTGATTTCTCCCTGCCGCCTCCTTCCAACCGCCG CCGCCATTGCCAGTGCATCTCCACGACAATAGGAGTGATCAAGAATGGT。
按类似的方法 ,获得样品 LO0456__11 和样品 LO0444__11 的所有标记位点的基因型。 C.9 计算遗传相似度
样品 LO0444__11 第 1 个标记位点的基因型为 :AAGATCACATTCTCACCTACAGAGAAAAGATT ACAGAAGAGAGAAAACAGCTTCCAGTAGAACTGCGCTGATTTCTCCCTGCCGCCTCCTTCCAA CCGCCGCCGCCATTGCCAGTGCATCTCCACGACAATAGGAGTGATCAAGAATGGT/AAGATCA CATTCTCACCTACAGAGAAAAGATTACAGAAGAGAGAAAACAGCTTCCAGTAGAACTGCGC
TGATT CCCCCCTGCCGCCTCCTTCCAACCGCCGCCGCCATTGCCAGTGCATCTCCACGACAATA GGAGTGATCAAGAATGGT,判定其与样品 LO0444__11 第 1 个标记位点的基因型不同(差异碱基用加粗字体和灰色背景显示)
依次判定样品 LO0444__11 与样品 LO0456__11 的 Nij = 492 个共同检出位点中 ,每个共同检出位点的
基因型是否有差异。 统计样品 LO0456__11 与样品 LO0444__11 中均检出的但基因型无任何差异的标记位
计算样品 LO0456__11 与样品 LO0444__11 的遗传相似度 GS 。
C.10 结果表述
待测品种贵三莲与对照品种沔城藕比较位点数为 492 ,差异位点数为 209 ,遗传相似度为 57 .52% ,判定为不同品种 ,为非实质性派生品种 .
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