ICS 65.020.20 CCS B 05
SDYY
团 体 标 准
T/SDYY 265—2026
五叶草莓脱毒组培快繁技术规程
Code of practice for tissue culture and rapid propagation for virus-free‘Fragaria
pentaphylla Losinsk. ’
2026 - 04 - 08 发布 2026 - 05 - 08 实施
山东园艺学会 发 布
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前 言
本文件按照 GB/T 1. 1-2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由山东园艺学会提出并归口。
本文件起草单位：青岛农业大学、尚好科技有限公司、山东省农业科学院、青岛市农业技术推广中心、青岛市农业科学研究院、成县连丰农产品有限责任公司、青岛华垦进出口有限公司、北京大学现代农业研究院。
本文件主要起草人：郑晓东、王彩虹、郁东兴、王俊峰、刘爱娜、李少旋、于连泽、鲍雯青、田义轲、赵强、孙志娟、王婵玉、刘萍、张庶、陈立勇、张蕊芬、周军会、梁咏琪、张瑶、孙泽春。
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五叶草莓脱毒组培快繁技术规程
1 范围
本文件界定了五叶草莓组培快繁的术语与定义，规定了外植体构建、初代培养、继代培养、生根培养、病毒检测等技术要求。
本文件适用于五叶草莓组培苗繁育。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 8599-2023 大型压力蒸汽灭菌器技术要求
DB13/T 5110-2019 植物组织培养室组建及操作技术规程
3 术语与定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
五叶草莓 Fragaria pentaphylla Losinsk
蔷薇科草莓属，二倍体植物。叶片呈羽状五小叶，质地较厚，小叶片倒卵形或椭圆形。聚伞花序，白色花瓣，果实呈白色或红色卵圆形，平均单果重为0.8 g~ 1.5 g ，表面密布棕红色斑点，其种子均凹于果面。
3.2
脱毒 Virus elimination
利用组织培养，去除感染病毒的草莓植株体内所携带的病毒，从而获得无病毒种苗的过程。
3.3
外植体 Explant
植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织片段。
4 外植体构建
4.1 外植体选取
选取健壮无病虫害的草莓植株，剪取当年生匍匐茎。以4月、5月、10月、11月晴天上午取材为宜。
4.2 外植体预处理
剪取匍匐茎顶端 2 cm～3 cm ，去除叶片和叶柄，用自来水流水冲洗 1 h ，沥干备用。
4.3 外植体消毒
4.3.1 前期准备
用75%酒精擦拭超净工作台台面，清除灰尘和杂物，紫外灯照射灭菌30 min～60 min ，之后通风10 min 。镊子、刀片、三角瓶等工具高温高压灭菌锅121℃灭菌25 min ，冷却后备用。
4.3.2 快速灭菌
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在超净工作台中将预处理后的匍匐茎放入无菌三角瓶，倒入75%乙醇，浸泡30 s ，期间轻轻摇晃三角瓶。然后倒出乙醇，立即用无菌水冲洗外植体3次，每次1 min～2 min。
4.3.3 深层灭菌
在三角瓶中倒入适量有效氯含量为1%的NaClO溶液，溶液应没过外植体，浸泡5 min～6 min ，期间轻轻摇晃三角瓶。然后倒出消毒剂，用无菌水冲洗外植体5次，每次2 min～3 min ，期间轻轻摇晃三角瓶，减少消毒剂残留。
5 初代培养
5.1 激素的母液配制
将所需的6-苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine ，6-BA) 、吲哚丁酸(Indole-3-butyric Acid ，IBA)用1mol/L NaOH溶解，再用蒸馏水稀释后分别配制成0. 1 mg/mL的母液，装入棕色广口瓶中，置于4℃冰箱保存。
5.2 初代培养基制备
按所需容量的 80%加蒸馏水，随后加入 Murashige & Skoog 培养基(M519 干粉)、3%蔗糖，稍加热搅拌至完全溶解。溶解后加入 0.5 mg/L 6-BA 和 0. 1 mg/L IBA ，用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 调节pH 至 5.8～6.0 。随后加入 0.7%琼脂并充分搅拌，高温高压灭菌锅 121℃灭菌 25 min 后分装备用，灭菌锅使用符合 GB 8599-2023 要求。
5.3 茎尖接种
在解剖镜下，用镊子逐层剥去小叶，直至露出半球形的生长点，用刀片切取0.2 mm～0.5 mm茎尖，生长点朝上接种在初代培养基上，一瓶接种3个～4个生长点为宜。
5.4 接种后管理
接种后，将培养瓶置于培养室培养，温度20℃~23℃ , 光照强度2000 lx ， 日均光照时长12 h/d ，培养室环境符合DB13/T 5110-2019要求。
6 继代培养
6.1 继代芽体选择
从初代接种日起算，培养30 d～40 d后，茎尖分化出不定芽，形成2 cm～3 cm高的丛生芽时可进行继代增殖。
6.2 继代培养基制备
按所需容量的80%加蒸馏水，随后加入M519干粉、3%蔗糖，稍加热搅拌至完全溶解。溶解后加入6-BA母液至终浓度0.5 mg/L和IBA母液至终浓度0.03 mg/L ，用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl调节pH至
5.8～6.0 。随后加入0.7%琼脂并充分搅拌，高温高压灭菌锅121℃灭菌25 min后分装备用。
6.3 继代苗接种
用无菌手术刀将单株苗从基部切下，去除愈伤，保证切口平整，避免撕裂，并将单株苗转接至继代培养基中。需注意的是，继代次数不宜超过 7 次，总培养时长不超过 1 年， 以防止组培苗发生变异。
6.4 接种后管理
接种后将组培苗置于光照强度2000 lx 、 日均光照时长12 h 、温度24℃~26℃ 、湿度60%～70%的培养室中培养。
7 生根培养
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7.1 生根培养基制备
按所需容量的 80%加蒸馏水，随后加入 M519 干粉、3%蔗糖，稍加热搅拌至完全溶解。溶解后加入 0.3 mg/L IBA ，用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 调节 pH 至 5.8～6.0 。完全溶解后加入 0.7%琼脂并充分搅拌，高温高压灭菌锅 121℃灭菌 25 min 后分装备用。
7.2 生根苗的选取与处理
从继代培养苗中，挑选健壮、无畸形、高度2.5 cm～3 cm 、带2片～3片展叶的单株苗，避免选用弱小苗、黄化苗和玻璃化苗。用无菌手术刀将单株苗从基部切下，保证切口平整，避免撕裂茎秆，若基部带有愈伤组织，需切除多余愈伤。
7.3 接种后管理
接种后将组培苗置于光照强度3000 lx 、 日均光照时长14 h 、温度24℃~26℃ 、湿度60%～70%的组培室中培养。从接种日起算，当生根至第35 d～45 d时，根系健壮、有分支，根数3条以上时，苗高2.5 cm~ 3 cm 、带2片～3片展叶时可进行驯化，驯化前需提前5 d～7 d开盖炼苗，逐步降低湿度，提高移栽成活率。
8 病毒检测
8.1 检测方法
在组培苗生根培养驯化前进行病毒检测，每批次组培苗随机抽取5%～10%的样本，采用RT-PCR(逆转录—聚合酶链式反应)检测。
8.2 检测步骤
8.2.1 RNA 提取
在超净工作台上切取五叶草莓组培苗叶片 0. 1 g～0.2 g ，放入无菌无酶的 2 ml 离心管，并放入 1 个钢珠做好相应标记，迅速置于液氮中备用。将样品放入组织研磨机中，研磨频率 70 Hz，研磨时间 90 s。按照试剂盒步骤(山东思科捷生物技术有限公司，新型植物 RNA 快速提取试剂盒，货号：AC0305)，提取总 RNA。
8.2.2 反转录
按照试剂盒步骤(山东思科捷生物技术有限公司，SPARKscript Ⅱ RT Plus Kit ，货号：AC0304)，得到cDNA 模板，置于-20℃暂存备用。
8.2.3 PCR 检测
用 primer 5.0 软件设计引物序列(参见附录 A)，在 PCR 管中依次加入 3 µL ddH2O、0.5 µLPrimer F、 0.5 µLPrimer R 、3 µL 2×Mix 、1 µL cDNA 并离心混匀，放入 PCR 仪中，扩增条件设置为 94℃预变性3 min;94℃变性 30 s ，52℃退火 30 s ，72℃延伸 1 min ，共 30 个循环;72℃延伸 10 min ，置于 4℃冰箱保存备用。
8.2.4 琼脂糖凝胶电泳
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