YY/T 1670.2-2025 医疗器械神经毒性评价 第2部分：神经细胞毒性试验

　　ICS11.040.01

CCS C30

中华人民共和国医药行业标准

YY/T1670.2—2025

医疗器械神经毒性评价

第2部分:神经细胞毒性试验

Neurotoxicityevaluationofmedicaldevices—Part2:Testsforneuro-cytotoxicity

2025-10-30发布2026-11-01实施

国家药品监督管理局发布

目 次

前言………………………………………………………………………………………………………… Ⅲ

引言………………………………………………………………………………………………………… Ⅳ

1 范围……………………………………………………………………………………………………… 1

2 规范性引用文件………………………………………………………………………………………… 1

3 术语和定义……………………………………………………………………………………………… 1

4 试验材料、培养基与试剂、仪器设备…………………………………………………………………… 1

4.1 试验材料…………………………………………………………………………………………… 1

4.2 培养基与试剂……………………………………………………………………………………… 1

4.3 仪器设备…………………………………………………………………………………………… 2

5 PC-12细胞毒性试验…………………………………………………………………………………… 2

5.1 试验原理…………………………………………………………………………………………… 2

5.2 试验设计…………………………………………………………………………………………… 2

5.2.1 试验策略……………………………………………………………………………………… 2

5.2.2 试验分组……………………………………………………………………………………… 3

5.3 试验步骤…………………………………………………………………………………………… 3

5.3.1 神经细胞活性评价试验……………………………………………………………………… 3

5.3.2 神经细胞形态评价试验……………………………………………………………………… 3

5.4 结果计算…………………………………………………………………………………………… 4

5.4.1 细胞活性计算………………………………………………………………………………… 4

5.4.2 神经细胞突起长度分析……………………………………………………………………… 4

5.5 试验可接受标准…………………………………………………………………………………… 5

5.5.1 活性评价试验可接受标准…………………………………………………………………… 5

5.5.2 形态评价试验可接受标准…………………………………………………………………… 5

5.6 结果分析…………………………………………………………………………………………… 5

6 试验报告………………………………………………………………………………………………… 5

参考文献……………………………………………………………………………………………………… 6

Ⅰ

YY/T1670.2—2025

前 言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本 文件为YY/T1670《医疗器械神经毒性评价》的第2部分。YY/T1670已经发布了以下部分:

———第1部分:评价潜在神经毒性的试验选择指南;

———第2部分:神经细胞毒性试验。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由国家药品监督管理局提出。

本文件由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会(SAC/TC248)归口。

本文件起草单位:中国食品药品检定研究院、山东省医疗器械和药品包装检验研究院、北京市医疗

器械检验研究院(北京市医用生物防护装备检验研究中心)、四川大学(四川医疗器械生物材料和制品检

验中心有限公司)。

本文件主要起草人:魏利娜、刘佳、王蕊、蔡永福、盖潇潇、贾文思、徐爽、贾莉芳、陈丽媛、方海燕、

陈亮。

Ⅲ

YY/T1670.2—2025

引 言

细胞毒性作为医疗器械/生物材料重要的安全性评价指标,如仅采用常规的细胞毒性评价方法,则

不能充分反映与神经系统直接或间接接触的医疗器械/生物材料对神经细胞特异的毒性作用。为了科

学地评价医疗器械/生物材料对神经细胞的潜在毒性风险,本文件提供了评价医疗器械/生物材料对神

经细胞毒性作用的标准化试验方法,为医疗器械/生物材料产品的研发提供技术支持。

体外细胞模型为快速筛选神经毒物提供有效工具,同时被用于神经毒性机理研究。来源于大鼠肾

上腺嗜铬细胞瘤的PC-12(或PC12)细胞系已被广泛用于神经毒性及其作用机制的评价与研究。根据

分化程度的不同,PC-12细胞系可分为高分化和未分化两大分支。PC-12高分化细胞贴壁生长,可通过

代谢活性测定细胞存活率,进行神经细胞活性评价。PC-12未分化细胞表达神经生长因子(NGF)受

体,在NGF的诱导下可产生神经元表型(形成神经细胞突起等),可用于神经细胞形态评价。

本文件通过医疗器械/生物材料浸提液对PC-12细胞活性与NGF诱导下产生的神经细胞突起等

形态学方面的改变,来评价试验样品潜在的神经细胞毒性。

YY/T1670旨在建立医疗器械神经毒性研究的试验方法,拟由两个部分构成。

———第1部分:评价潜在神经毒性的试验选择指南。目的在于给出医疗器械潜在神经毒性的试验

选择指南。

———第2部分:神经细胞毒性试验。目的在于给出医疗器械神经细胞毒性的试验方法。

Ⅳ

YY/T1670.2—2025

医疗器械神经毒性评价

第2部分:神经细胞毒性试验

1 范围

本文件描述了对医疗器械/生物材料进行神经细胞毒性评价的试验方法。

本文件适用于直接或间接与神经系统接触的医疗器械/生物材料的神经细胞毒性评价。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文

件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于

本文件。

GB/T16886.5 医疗器械生物学评价 第5部分:体外细胞毒性试验

GB/T16886.12 医疗器械生物学评价 第12部分:样品制备与参照材料

3 术语和定义

GB/T16886.5界定的术语和定义适用于本文件。

4 试验材料、培养基与试剂、仪器设备

4.1 试验材料

主要材料及要求如下。

a) 细胞系:推荐采用PC-12(高分化)与PC-12(未分化)细胞系用于试验,细胞应无支原体污染。

b) 试验样品:试验样品应无菌。按照GB/T16886.12要求,根据试验样品特点选择适宜的浸提

条件制备试验样品浸提液(可参考细胞毒性试验的浸提条件和方法),细胞活性评价和形态评

价试验应分别使用相应的细胞培养基作为浸提介质。

c) 阴性对照:推荐使用高密度聚乙烯等经验证无神经细胞毒性的材料,与试验样品采用相同条件

同步制备;若使用试剂(如10%磷酸盐缓冲液)作为阴性对照,则使用同步制备的空白对照培

养基配制。

d) 阳性对照:推荐使用经验证具有显著神经细胞毒性的材料/试剂(如硫酸长春新碱、氯化甲基

汞、二甲基亚砜等)作为阳性对照,应与试验样品采用相同条件同步制备或使用同步制备的空

白对照培养基配制。

e) 空白对照:不含试验样品的浸提介质,与试验样品采用相同条件同步制备。

4.2 培养基与试剂

细胞培养基与主要试剂如下:

a) 1640细胞培养基(含谷氨酰胺,不含酚红);

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YY/T1670.2—2025

b) 胎牛血清(FBS);

c) 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)溶液;

d) 青霉素-链霉素(PS)溶液;

e) 磷酸盐缓冲液(PBS);

f) 3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑蓝(MTT);

g) 细胞计数试剂盒(CCK-8);

h) 神经生长因子(NGF);

i) 多聚-L-赖氨酸溶液(PLL);

j) 层黏连蛋白(Laminin);

k) 马血清(HS)。

4.3 仪器设备

主要仪器设备如下:

a) 细胞培养箱:37℃,湿化、5%(体积分数)CO2/空气;

b) 生物安全柜或超净工作台;

c) 倒置相差显微镜;

d) 荧光显微镜;

e) 酶标仪或孔板光度计;

f) 离心机;

g) 电子天平;

h) 恒温水浴箱;

i) 恒温振荡器。

5 PC-12细胞毒性试验

5.1 试验原理

PC-12(高分化)细胞活性可采用MTT法或CCK8法进行评价。GB/T16886.5—2017附录C给出

了MTT试验方法。采用CCK-8细胞计数试剂评价细胞活性,试验原理类似于MTT 法。CCK-8试剂

中含有2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐(WST-8),在电子

载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-MethoxyPMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具

有高度水溶性的黄色甲臜产物,生成的甲臜产物的数量与活细胞的数量成正比。在450nm 波长处测

定其光密度(OD)值,可间接反映活细胞数量。

以PC-12(未分化)细胞在NGF诱导分化后形成的神经细胞突起的长度为评价指标,从形态学上辅

助评价材料对PC-12细胞的毒性作用。神经细胞突起是神经细胞形态的显著特征,具有神经毒性的物

质可抑制神经细胞突起的形成,神经毒性的大小与神经细胞突起被抑制的程度相关,故测量并比较各组

细胞平均神经细胞突起长度,可定量评价待测材料对神经细胞形态的影响。

5.2 试验设计

5.2.1 试验策略

采用PC-12高分化细胞活性及PC-12未分化细胞形态两个指标来评价医疗器械/生物材料的神经

细胞毒性,其中,以细胞活性为主要评价指标,细胞形态为次要评价指标。当神经细胞活性评价试验提

示具有较强的神经细胞毒性时,可考虑不再进行神经细胞形态评价试验。

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YY/T1670.2—2025

5.2.2 试验分组

除试验样品组,试验应设置空白对照组、阴性对照组和阳性对照组,保证试验体系有效并有助于结

果的解释。

5.3 试验步骤

5.3.1 神经细胞活性评价试验

5.3.1.1 培养基

完全培养基:在1640细胞培养基中添加10%FBS、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素。

完全培养基宜在2℃~8℃保存,且贮存时间不超过两周。

5.3.1.2 细胞接种

贮存PC-12(高分化)细胞复苏后,在用于试验之前应传代2次~3次。

将预先培养至近汇合状态的PC-12细胞用0.25%胰蛋白酶消化、计数,用完全培养基重悬细胞悬

液,调整密度为1×105 个细胞/mL后接种于96孔细胞培养板。

96孔细胞培养板的外围孔中加入100μL完全培养基,在其余孔中加入100μL密度为1×105 个细

胞/mL的细胞悬液。

将96孔细胞培养板置于5%(体积分数)CO2 细胞培养箱内,(37±1)℃培养(24±2)h。

5.3.1.3 更换培养基

培养24h后,相差显微镜下检查每个孔,初步观察有无细胞接种系统误差。

除去原培养基,每孔加入100μL采用完全培养基浸提或配制的试验样品浸提液、阴性对照、阳性对

照或同步制备的空白对照培养基。试验样品浸提液宜至少有2个浓度梯度,最高浓度宜采用100%浸

提液组,推荐包含50%浸提液组。每组6复孔。

为了检查细胞接种系统误差,推荐将空白对照组设置在96孔板的左(第2列)、右(第11列)两侧。

将细胞培养板置于5%(体积分数)CO2 细胞培养箱内,(37±1)℃培养(24±2)h。

5.3.1.4 细胞形态观察及活性检测

培养(24±2)h后,相差显微镜下检查每个板,判定细胞接种系统误差以及试验组与对照组细胞的

生长特性,并拍照记录各组细胞形态学方面的改变。

每孔加入10μL的CCK-8溶液,5%(体积分数)CO2、(37±1)℃继续培养2h,测定各组在450nm

处的OD值。

5.3.2 神经细胞形态评价试验

5.3.2.1 培养基

增殖培养基:1640培养基含10%HS、5%FBS、100IU/mL青霉素与100μg/mL链霉素。增殖培

养基用于未分化PC-12细胞的扩增传代。

分化培养基:1640细胞培养基含5% FBS、50ng/mLNGF、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉

素。分化培养基用于诱导未分化PC-12细胞产生神经细胞表型。

分化培养基与增殖培养基宜在2℃~8℃保存,且贮存时间不超过两周。

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5.3.2.2 细胞培养板表面包被处理和细胞接种

5.3.2.2.1 细胞培养板表面包被处理

未分化的PC-12细胞定向分化成神经元,细胞培养板表面应先经PLL与Laminin包被处理,具体

步骤如下:

a) PLL包被:每孔加入400μL质量浓度为50μg/mL的PLL溶液(用无菌纯水配制),(37±1)℃孵

育2h或2℃~8℃过夜;

b) 洗板:除去每孔PLL溶液,每孔加入600μL无菌纯水,轻轻晃动约30s后吸除,重复3遍;

c) Laminin包被:每孔加入400μL质量浓度为25μg/mL的Laminin溶液(用不含血清与NGF

的1640细胞培养基配制),(37±1)℃孵育2h或2℃~8℃过夜;

d) 吸除Laminin溶液后接种细胞。

5.3.2.2.2 细胞接种

贮存PC-12(未分化)细胞复苏后,在用于试验之前应采用增殖培养基传代2次~3次。细胞传代、

计数后接种于培养表面经PLL与Laminin包被处理后的24孔细胞培养板。

采用分化培养基将细胞悬液浓度调至1×104 个/mL,每孔接种1mL细胞悬液。

将细胞培养板置于5%(体积分数)CO2 细胞培养箱内,(37±1)℃培养(24±2)h。

注:为避免接种后细胞分布不均,推荐细胞接种后1h~2h再转移至细胞培养箱。

5.3.2.3 更换培养基

培养(24±2)h后,除去原分化培养基,每孔加入1mL采用分化培养基浸提或配制的试验样品浸提

液、阴性对照、阳性对照或同步制备的空白对照分化培养基。试验样品浸提液宜设置2个浓度梯度,推

荐增加50%浸提液组。每组4复孔。

将细胞培养板置于5%(体积分数)CO2 细胞培养箱内,(37±1)℃培养(48±2)h。

5.3.2.4 细胞形态观察与记录

培养(48±2)h后,相差显微镜下检查每个组,并拍照记录各组细胞形态。

每孔随机拍摄至少3个不同区域的细胞形态图像,合计90~110个细胞用于神经细胞突起分析。

细胞图像可采用相差显微镜在明场下直接采集,亦可经细胞骨架(如神经丝蛋白、βⅢ微管蛋白等)

与细胞核荧光染色后采集。荧光染色后采集图像有助于软件自动分析。

5.4 结果计算

5.4.1 细胞活性计算

按公式(1)计算各试验组PC-12细胞相对存活率。

RCV=OD450T/OD450B ×100% …………………………(1)

式中:

RCV ———相对存活率;

OD450T———各试验组OD平均值与外围孔试剂空白OD平均值的差值;

OD450B ———空白对照组OD平均值与外围孔试剂空白OD平均值的差值。

5.4.2 神经细胞突起长度分析

各试验组PC-12细胞以单孔为统计单元,5.3.2.4中拍照记录的所有神经细胞的突起长度之和除以

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YY/T1670.2—2025

细胞数为该孔平均神经细胞突起长度。各试验组平均神经细胞突起长度为各复孔的平均值,结果以平

均值±标准差(x±s)表示。

采用合适的统计学分析方法(如单因素方差分析,具体以实际数据为准),对比分析各试验组与空白

对照组平均神经细胞突起长度的差异,以P <0.05为差异有统计学意义。

5.5 试验可接受标准

5.5.1 活性评价试验可接受标准

神经细胞活性评价试验体系成立的条件:

a) OD450B≥0.2;

b) 左、右两列空白对照组OD平均值与全部空白对照组平均值相差不大于15%;

c) 阴性对照组细胞相对存活率不低于70%,阳性对照组细胞相对存活率不高于50%。

5.5.2 形态评价试验可接受标准

神经细胞形态评价试验体系成立的条件:

a) 阳性对照组平均神经细胞突起长度低于空白对照组,且两组间差异有统计学意义(P <0.05);

b) 阴性对照组平均神经细胞突起长度与空白对照组差异无统计学意义(P ≥0.05)。

5.6 结果分析

相对存活率较低时,试验样品的神经细胞毒性较高。试验样品的细胞相对存活率低于70%时,则

具有潜在的神经细胞毒性。试验样品50%浸提液组相对存活率宜不低于100%浸提液组,否则宜重复

试验。

试 验样品组平均神经细胞突起长度低于空白对照组,且两组间差异具有统计学意义(P <0.05)

时,提示试验样品可能抑制神经细胞突起的形成。

试验样品细胞相对存活率低于50%时,可不再进行神经细胞形态评价试验。

6 试验报告

试验报告中应包含下列信息:

———试验样品名称、规格型号和批号;

———试验样品浸提液制备方法;

———阴性和阳性对照品;

———细胞系选择和细胞来源;

———试验条件和试验步骤;

———试验结果;

———结果分析;

———结论。

5

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参 考 文 献

[1] GB/T16886.5—2017 医疗器械生物学评价 第5部分:体外细胞毒性试验

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[3] RadioNM,FreudenrichTM,RobinetteBL,CroftonKM,Mundy WR:Comparisonof

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