SN/T 1439-2025 国境口岸埃博拉病毒检验

　　ICS 11. 020

CCS C 62

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T 1439—2025

代替SN/T 1439—2013

2025‑07‑25 发布2026‑02‑01 实施

国境口岸埃博拉病毒检验

Test methods for Ebola virus at frontier ports

中华人民共和国海关总署　　发　布

SN/T 1439—2025

前言

本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件代替SN/T 1439—2013《国境口岸埃博拉病毒分子生物学检测方法》，与SN/T 1439—2013

相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：

——删除了当前极少实验室开展的电子显微镜检查、埃博拉病毒抗原检测(ELISA 法)、间接免疫荧

光试验、免疫印迹试验、基因芯片试验等(见2013 年版的8.3);

——针对四种对人类有致病性的埃博拉病毒，更改了病毒核酸检测方法(见附录E、附录C，2013 年

版的8.1 和8.2);

——增加了世界卫生组织推荐的现场快速检测方法(见附录B);

——增加了埃博拉病毒的分离和鉴定方法(见附录B)。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。

本文件起草单位：广州海关技术中心、中国科学院武汉病毒研究所。

本文件主要起草人：黄吉城、林志伟、王冰、郑夔、孙芳芳、袁帅、戴俊、师永霞、黄弋。

本文件及其所代替或废止文件的历次版本发布情况为：

——2004 年首次发布为SN/T 1439—2004，2013 年第一次修订;

——本次为第二次修订。

Ⅰ

SN/T 1439—2025

引言

埃博拉出血热，是由丝状病毒科的埃博拉病毒导致的一种严重且往往致命的疾病，临床表现主要为

发热、出血和多器官损伤。人主要通过接触病人或感染动物的体液、排泄物、分泌物等而感染。

在现有标准SN/T 1439—2013《国境口岸埃博拉病毒分子生物学检测方法》、SN/T 4346.8—2015

《国境口岸烈性接触性传染病卫生检疫技术规范　第8 部分：实验室检测》和SN/T 1231—2010《国境口

岸埃博拉出血热和马尔堡出血热疫情监测与控制规程》基础上进行修订，剔除了一些不适合口岸检测的

方法，补充完善世界卫生组织推荐的抗原快速检测方法，优化基因检测方法的引物和探针设计方案。

Ⅱ

SN/T 1439—2025

国境口岸埃博拉病毒检验

1 范围

本文件规定了国境口岸埃博拉病毒的检验对象，生物安全和PCR 防污染要求，标本采集、运送与保

存，检验方法与结果报告。

本文件适用于对国境口岸可疑病人进行埃博拉病毒检验。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅

该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB 19489　实验室　生物安全通用要求

WS/T 230　实时荧光聚合酶链反应　临床实验室应用指南

WS/T 573　感染性疾病免疫测定程序及结果报告

病原微生物实验室生物安全管理条例

人间传染的病原微生物目录

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

埃博拉病毒病 Ebola virus disease

由丝状病毒科的埃博拉病毒导致的一种严重且往往致命的疾病，临床表现主要为发热、出血和多器

官损伤。人主要通过接触病人或感染动物的体液、排泄物、分泌物等而感染。

注： 以往称作埃博拉出血热。

3.2

埃博拉病毒 Ebola virus

属丝状病毒科，为单股负链RNA 病毒。埃博拉病毒属中，有六个种已得到确认，分别为扎伊尔、苏

丹、塔伊森林、本迪布焦、雷斯顿和邦巴里病毒。其中，只有四种(扎伊尔、苏丹、塔伊森林、本迪布焦埃博

拉病毒)在人类中引发疾病。

3.3

逆转录-聚合酶链式反应 reverse transcription PCR;RT‑PCR

聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT‑PCR 中，由一条RNA 单链转录为互补

DNA(cDNA)的过程称为“逆转录”，由依赖RNA 的DNA 聚合酶(逆转录酶)完成。随后，DNA 的另一

条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA 的DNA 聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的

RNA 模板被RNA 酶降解，留下互补DNA。

3.4

实时荧光PCR　real‑time PCR

在PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测，即通过对PCR 扩增反应中每一个

1

SN/T 1439—2025

循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板的定量及定性分析。

注： 在实时荧光PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累积，荧光信号

强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，从而得到一条荧光扩增曲线图。多重荧光PCR

则是在扩增产物的检测上引入两种或多种荧光信号，根据不同荧光信号强度的变化反映相应检测靶标的扩增情

况，从而达到同一次PCR 扩增反应同时检测多种检测靶标的目的。

3.5

免疫层析 immuno‑chromatography assay;I CA

将特异性抗体(或抗原)先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品

后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有特异性抗体(或抗原)的区域时，样品中

相应的抗原(或抗体)即与该抗体(或抗原)发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显

示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。

4 检测对象

4.1 埃博拉病毒病留观病例、疑似病例和确诊病例。

4.2 其他申请埃博拉病毒检验的人员样本。

5 生物安全和PCR 防污染要求

实验室生物安全应符合GB 19489 和《病原微生物实验室生物安全管理条例》中的规定。PCR 防污

染措施按WS/T 230 的规定执行。

埃博拉病毒相关的未经培养的感染性材料的操作应在生物安全三级(BSL-3)实验室内进行。

埃博拉病毒相关的灭活材料的操作在生物安全二级(BSL-2)实验室内进行。

埃博拉病毒感染材料的运输包装分类为A 类，UN 编号为UN 2814，采用三层包装系统。

6 样本采集、运送与保存

6.1 血液样本采集

6.1.1 抗凝全血样本采集方法：以含EDTA 抗凝剂的紫色橡胶盖无菌真空抗凝采血管采血3 mL。采血

后立即颠倒混匀，使抗凝剂与血液充分混合。采血管上应有个人信息的唯一性标识。置4 ℃冰箱冷藏，

并尽快低温运送到实验室待进一步检测。

6.1.2 口腔拭子样本采集方法：采集口腔拭子时，一只手按压被采样者下巴使嘴张开，取出聚酯拭

子，以旋转拭子的方式擦拭脸颊双内侧，收集唾液和脱落细胞，取出后将拭子头浸入病毒运输液中，

折断拭子尾部，弃去，旋紧管盖并做好标识。置4 ℃ 冰箱冷藏，并尽快低温运送到实验室待进一步

检测。

6.2 样本的运送与保存

样本于2 ℃~8 ℃ 下运送至实验室检测。上述样本如72 h 内不能送到实验室，应置于-70 ℃ 保

存。样本运输应按照相关生物安全规定，采取三层包装系统A 类包装，低温冷藏运输，避免反复

冻融。

2

SN/T 1439—2025

7 检验方法与结果报告

埃博拉病毒核酸检验的样本处理及病毒RNA 提取按附录A 进行;胶体金免疫层析法快速检验埃博

拉病毒抗原及结果报告按附录B 进行;实时荧光RT‑PCR 检验及结果报告按附录C 进行;埃博拉病毒

病毒分离鉴定及结果报告按附录D 进行;常规RT‑PCR 检验、测序分析及结果报告按附录E 进行。

3

SN/T 1439—2025

附录A

(规范性)

埃博拉病毒核酸检验的样本处理及病毒RNA 提取

A.1 核酸提取的准备

A.1.1 核酸提取试剂

QIAamp Viral RNA Mini Kit 试剂盒1) 、TRIzol®LS 试剂2) 、无水乙醇。

A.1.2 核酸提取设备及消耗品

下面仅列出埃博拉病毒核酸提所需的常用仪器设备及消耗品：

——移液器(1 000 μL);

——带滤芯的移液器Tip(1 000 μL);

——移液器(200 μL);

——带滤芯的移液器Tip(200 μL);

——一次性巴氏吸管(已灭菌);

——核酸提取试剂盒配套2 mL 收集管;

——核酸提取试剂盒配套过滤柱;

——5 mL Eppendorf 离心管;

——离心管架;

——镊子;

——样本转移盒;

——螺旋盖50 mL 离心管;

——样本保存管。

A.1.3 消毒防护用品及其他

下面仅列出埃博拉病毒消毒防护等用品：

——废液桶(含5 000 mg/L 有效氯消毒液);

——吸水垫;

——记录纸和记录笔;

——记号笔;

——计时器;

——纱布(泡在1 000 mg/L 有效氯消毒液中);

——1 000 mg/L 有效氯消毒液(装在喷壶中);

——吸水纸;

——去离子水(装在喷壶中);

1) 给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一(或这些)产品的认可。

2) 给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一(或这些)产品的认可。

4

SN/T 1439—2025

——橡皮筋;

——75% 酒精(装在喷壶中);

——长镊子;

——干纱布;

——1 000 mg/L 有效氯消毒液(装在吸瓶中);

——消毒袋;

——纱布防刺手套;

——应急处理杯。

A.2 样本接收

A.2.1 铺一张送样箱底部大小的试验防水垫。

A.2.2 1% 含氯消毒液喷洒;送样箱放置在垫上。

A.2.3 喷洒外表面消毒;放入BSL-3 实验室传递柜。

A.2.4 要求送样人员填写好相关样本信息。

A.3　进入BSL-3 实验室

A.3.1 准备好相应物品。

A.3.2 按要求穿戴好个人防护装备。

A.3.3 进入BSL-3 实验室;检查实验室内部压力、电气、蒸汽灭菌器等相关试验设施设备。

A.3.4 开启主实验室生物安全柜，预先运行10 min。

A.3.5 将试验物品、送样箱等通过平推车转移至主实验室。

A.3.6 放置好高压袋、废物桶;在第二缓冲区铺防水垫等。

A.4 样本处理

A.4.1 送样箱放入安全柜内的防水垫上。

A.4.2 取出内层样品保护桶(盒)。

A.4.3 送样箱内表面喷洒1% 含氯消毒液。

A.4.4 用上述消毒液浸湿的纱布擦拭保护桶(盒)外表面。

A.4.5 小心取出样本，注意观察如内含锐利物时应用镊子小心取出。

A.4.6 样本管完全浸入一含40 mL 上述消毒液的50 mL 离心管，放置10 min。

A.4.7 送样箱和内层保护桶(盒)移出安全柜。

A.4.8 内层保护桶(盒)用单独灭菌袋包装，等待高压消毒后重复使用;送样箱暂时放进传递柜。

A.4.9 开启紫外灯继续消毒;同时准备后续试验所需物品。

A.5 核酸提取

A.5.1 小心用镊子取出50 mL 离心管中的样本管。

A.5.2 放在一用上述消毒液浸湿的纱布上裹起。

A.5.3 另一只手同样用一浸湿消毒液的纱布覆盖在管盖上。

A.5.4 缓缓地旋转打开。

A.5.5 用带滤芯Tip 头的移液器吸取70 μL 全血样本。

A.5.6 加入至700 μL TRIzol®LS 中(预先加入6 μL Carrier RNA)。

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SN/T 1439—2025

A.5.7 加样后的Tip 头丢弃前先在吸入50 mL 离心管内的消毒液后再弃入垃圾桶。

A.5.8 颠倒混匀后室温放置10 min。

A.5.9 加入620 μL 无水乙醇并混匀。

A.5.10 分两次每次700 μL，转至QIAamp Mini Spin Columns 硅胶膜吸附柱3)上，离心。

A.5.11 然后按QIAamp Viral RNA Mini Kit 试剂盒说明书完成洗涤步骤。

A.5.12 用50 μL AVE 洗脱RNA。

A.5.13 样本RNA 在擦拭消毒管壁后转到BSL-3 实验室外进行后续试验。

A.5.14 如需留样，取完样后再轻轻盖紧，放入50 mL 离心管中，表面消毒后取出，保存于-70 ℃冰箱，否

则盖紧后直接丢入垃圾桶内待高压消毒处理。

3)　给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一(或这些)产品的认可。

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SN/T 1439—2025

附录B

(规范性)

胶体金免疫层析法快速检验埃博拉病毒抗原

B.1 试剂

采用ReEBOV Antigen Rapid Test Kit 试剂盒4)进行胶体金免疫层析法快速检测埃博拉病毒抗原。

B.2 原理

一种基于双抗体夹心反应的免疫层析技术，用于对全血或血浆样本中的埃博拉病毒VP 40 抗原进行

定性快速检测。样本中的埃博拉病毒VP 40 抗原与试剂条样本垫中特异性VP 40 抗体结合，而样本垫中

的特异性VP 40 抗体预先标记有纳米金颗粒，从而形成特异性的金标记的抗原-抗体复合物。在缓冲液

作用下向试剂条另一端迁移，被固相包被在一条检测线上的特异性VP 40 抗体所捕捉固定，呈现出一条

粉-红色的检测线，提示血样中埃博拉病毒VP 40 抗原的存在;同时，质控线上的固相包被成分可捕捉随

样本迁移的游离纳米金颗粒，呈现出一条粉-红色的质控线，以提示试剂的有效性。由于检测结果可在

15 min~25 min 内以肉眼做出判断，因此这是一种现场快速检测方法。

B.3 试验步骤

试验步骤如下：

a) 试剂先从2 ℃~8 ℃冰箱中取出，待平衡到室温后再使用;

b) 按待检样本数取出相应数量的试剂条和测试管;

c) 先把测试管垂直放置在管架上，每支管加入4 滴缓冲液;

d) 打开相应试剂条的外包装;

e) 针对全血或血浆样本(现场一般采手指或耳垂末梢血)：

1) 用移液器加30 μL 样本(也可用试剂盒提供的抗凝毛细管滴加一整滴)于样本垫中;

2) 待样本被样本垫完全吸收后，随即将样本垫一端浸入含缓冲液的测试管中，盖好管盖;

3) 静置等待15 min~25 min，直至质控线出现稳定的粉-红色后读取结果。

B.4 结果判定与报告

B.4.1 结果判定

参照试剂盒说明书进行具体结果判定。

a) 抗原检测阳性：检测线和质控线均呈现出粉-红色，判定为抗原检测阳性。如检测线上只有一部

分呈现出粉-红色，也可判定为阳性，但建议重测。

b) 抗原检测阴性：检测线无色而质控线呈现出粉-红色，判定为抗原检测阴性。

c) 无效结果：质控线无色，判定为无效结果(即使检测线有粉-红色)。

B.4.2 结果报告

阴性检测结果报告为“埃博拉病毒抗原检测阴性(免疫层析法)”，阳性检测结果报告为“埃博拉病毒

抗原检测阳性(免疫层析法)”。阴性结果不能排除埃博拉病毒感染，阳性结果需进一步核实检测。

4)　ReEBOV Antigen Rapid Test Kit 试剂盒是由美国Corgenix 公司提供的产品的商品名，是世界卫生组织紧急授权

使用的埃博拉病毒现场快速检测试剂盒，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可。

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SN/T 1439—2025

附录C

(规范性)

实时荧光RT‑PCR 检验

C.1 主要设备

主要设备如下：

a) 荧光定量PCR 仪;

b) 二级生物安全柜;

c) 高压灭菌锅;

d) 低温高速离心机：最大离心力20 000g;

e) 漩涡振荡器;

f) 冰箱：4 ℃、-20 ℃和-70 ℃;

g) 移液器：2.5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL 和1 mL。

C.2 主要试剂

主要试剂如下：

a) 核酸提取试剂;

b) 实时荧光RT‑PCR 基础试剂;

c) 检测引物和探针(见表C.1、表C.2)。

表C.1　同时检测苏丹型和扎伊尔型埃博拉病毒的通用引物和探针

引物/探针

EBOV(SZ)-UP

EBOV(SZ)-DP

EBOV(SZ)-Pro

注：简并碱基中W 表示T 或A，R 为A 或G，Y 为C 或T，探针EBOV(SZ)-Pro5'端标记HEX 荧光报告基团，3'

端均标记BHQ1 荧光淬灭基团。等效的引物和探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用。

序列(5'-3')

GAGCAAGGGCTSATWCAATATCCAAC

CATGTGCATCCCYTGRTGTATTAG

CACCATCATGTGTCCWACTGATTGCC

表C.2　同时检测本迪布焦型和塔伊森林型埃博拉病毒的通用引物和探针

引物/探针

EBOV(BT)-U

EBOV(BT)-D

EBOV(BT)-Pro

注：简并碱基中R 为A 或G。探针EBOV(BT)-Pro 的5'端标记FAM 荧光报告基团，3'端均标记BHQ1 荧光淬灭

基团。等效的引物和探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用。

序列(5'-3')

ATCCTGAAAGACTTCCATCAGA

TCTTTCCGTAGTGTGACCAT

CAGCTTCCAGCAGACRACAGCC

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SN/T 1439—2025

C.3 核酸提取

见附录A。

C.4 实时荧光RT‑PCR 反应

C.4.1 反应体系

反应体系为20 μL，按照表C.3 进行配制。

表C.3　实时荧光RT‑PCR 反应体系

反应体系成分

2×RT-PCR 缓冲液

EBOV(SZ)-UP

EBOV(SZ)-DP

EBOV(SZ)-Pro

EBOV(BT)-U

EBOV(BT)-D

EBOV(BT)-Pro

25×RT‑PCR Enzyme Mix

RNA 模板

DEPC 水

加样量(体积或浓度)

9 μL

0.4 μmol/L

0.4 μmol/L

0.2 μmol/L

0.4 μmol/L

0.4 μmol/L

0.2 μmol/L

0.8 μL

6.2 μL

补足至总体积20 μL

C.4.2 扩增程序

反应条件为：50 ℃、10 min;95 ℃、10 min;95 ℃变性5 s，58 ℃退火45 s，45 个循环。在58 ℃退火阶段

收集FAM 通道荧光[EBOV(BT)-Pro]和HEX 通道荧光[EBOV(SZ)-Pro]，用仪器自动进行结果分析。

反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。

C.4.3 阳性对照、阴性对照和空白对照设置

检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为根据埃博拉病毒相应扩增片段经人

工合成并体外转录的模板RNA(序列参见附录F);阴性对照为正常人样本;空白对照为DEPC 水。

C.5 结果判定

C.5.1 质量控制

反应结果应同时符合以下2 个条件：

a) 阴性对照、空白对照无扩增曲线;

b) 阳性对照Ct≤35[FAM 通道：EBOV(BT)-tem 基因;HEX 通道：EBOV(SZ)-tem 基因]并有明

显扩增曲线。

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SN/T 1439—2025

C.5.2 结果判定与报告

当同时进行的阳性对照、阴性对照、空白对照试验结果正常时，本方法检验结果判定和报告如下：

a) fam 通道、HEX 通道无明显扩增曲线，判为阴性，报告“未检出埃博拉病毒特异性基因(实时荧光

RT-PCR 法)”;

b) fam 通道无明显扩增曲线，HEX 通道有明显扩增曲线，且Ct 值≤40，判为阳性，报告“检出苏丹

型/扎伊尔型埃博拉病毒特异性基因(实时荧光RT‑PCR 法)”;

c) fam 通道有明显扩增曲线，HEX 通道无明显扩增曲线，且Ct 值≤40，判为阳性，报告“检出本迪

布焦型/塔伊森林型埃博拉病毒特异性基因(实时荧光RT‑PCR 法)”;

d) 有明显扩增曲线，且40

明显的对数增长期，报告“检出埃博拉病毒特异性基因(实时荧光RT‑PCR 法)”。

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SN/T 1439—2025

附录D

(规范性)

埃博拉病毒病毒分离鉴定

D.1 生物安全要求

实验室病原学和血清学检测相关活动严格按照《人间传染的病原微生物目录》的要求，在相应的生物

安全级别实验室开展。病毒培养在BSL-4 实验室、动物感染试验在ABSL-4 实验室、未经培养的感染材

料的操作在BSL-3 实验室、灭活材料的操作在BSL-2 实验室、无感染性材料的操作在BSL-1 实验室中

进行。

D.2 试验材料

下面仅列出埃博拉病毒分离培养需要的基本材料：

a) 样本：发病7 天内患者的血清或其他疑似感染性样本;

b) 细胞：Vero 细胞;

c) 培养基：DMEM(含10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素)。

D.3 方法

D.3.1 提前一天准备Vero 细胞使单层细胞第二天长至70%，细胞状态观察无异常可用于病毒分离。

D.3.2 从-80 ℃冰箱中取出样本(血液样本或其他疑似样本)。

D.3.3 待样本解冻后，在生物安全柜内取适量体积样本至5 mL 离心管中。

D.3.4 4 ℃ 8 000g 离心10 min 后，将上清转移至另一离心管。

D.3.5 4 ℃ 10 000g 离心10 min 后，将上清转移至另一离心管。

D.3.6 4 ℃ 13 000g 离心10 min 后，将上清转移至另一离心管。

D.3.7 吸取200 μL 上清加入800 μL 的无血清DMEM 培养基，轻柔混匀后加入到准备好的细胞中，37 ℃

孵育1 h。

D.3.8 在生物安全柜内加入4 mL 的含5% 血清的DMEM 培养基，放入37 ℃培养箱培养。

D.3.9 持续观察细胞病变，持续1 周~2 周，必要时取培养上清再次感染新的细胞，重复2 次~3 次。

D.4 结果判定与报告

疑似样本感染后，持续观察细胞病变情况，培养持续1 周~2 周，或传代培养，直至细胞出现细胞变

圆、漂浮，甚至细胞破碎等不同于健康细胞对照的明显病变，并经实时荧光RT‑PCR 检测、基因测序等方

法鉴定证实，报告为“检出埃博拉病毒”。

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SN/T 1439—2025

附录E

(规范性)

常规RT‑PCR 检验及测序分析

E.1 主要设备

主要设备如下：

a) PCR 扩增仪;

b) 千分之一天平;

c) 二级生物安全柜;

d) 高压灭菌锅;

e) 低温高速离心机：最大离心力20 000g;

f) 电泳仪;

g) 凝胶成像分析系统;

h) 漩涡振荡器;

i) 移液器：2.5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL 和1 mL。

E.2 主要试剂

主要试剂如下：

a) 核酸提取试剂;

b) RT‑PCR 基础试剂;

c) 检测引物(见表E.1、表E.2)。

表E.1　同时扩增苏丹型和扎伊尔型埃博拉病毒NP 基因片段的通用引物

引物

EBOV(SZ)NP-U

EBOV(SZ)NP-D

注：引物扩增片段长500 bp;序列中的简并碱基Y 表示T 或C。等效的引物或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用。

序列(5'-3')

CAATCAGTWGGACACATGATGGTGA

GCATATTGTTGGAGTTGCTTYTCAGC

表E.2　同时扩增本迪布焦型和塔伊森林型埃博拉病毒NP 基因片段的通用引物

引物

EBOV(BT)NP-U

EBOV(BT)NP-D

注：引物扩增片段长596 bp;序列中的简并碱基Y 表示T 或C。等效的引物或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用。

序列(5'-3')

GGACACATGATGGTCATYTTCAGACT

GCTGTTGTCTGCTGGAAGCTGAT

E.3 核酸提取

见附录A。

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SN/T 1439—2025

E.4 RT‑PCR 反应

E.4.1 反应体系

反应体系为50 μL，按照表E.3 进行配制。

表E.3　RT‑PCR 反应体系

反应体系成分

2×One Step Mix

EBOV(SZ)NP‑U/EBOV(SZ)NP‑D 或EBOV(BT)NP‑U/EBOV(BT)NP‑D

One step Enzyme Mix

RNA/模板

DEPC 水

注：扩增扩增苏丹型和扎伊尔型埃博拉病毒NP 基因片段用引物EBOV(SZ)NP‑U/EBOV(SZ)NP‑D;扩增本迪布

焦型和塔伊森林型埃博拉病毒NP 基因片段用引物EBOV(BT)NP‑U/EBOV(BT)NP‑D。

加样量(体积或浓度)

25 μL

各0.4 μmol/L

2.5 μL

5 μL

补足至总体积50 μL

E.4.2 扩增程序

50 ℃逆转录30 min，94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 1 min，30 个循环;4 ℃保

存。反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。

E.4.3 阳性对照、阴性对照和空白对照设置

检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为根据埃博拉病毒相应扩增片段经人

工合成并体外转录的模板RNA(序列参见附录F);阴性对照为正常人标本;空白对照为ddH2O。

E.5 凝胶电泳

扩增结束后，在5 μL 扩增产物中加入1 μL 6×DNA 上样缓冲液，用含10 000×DMSO 核酸凝胶染料

去染1% 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，用凝胶成像系统照相记录结果。

E.6 结果判定

E.6.1 质量控制

反应结果应同时符合以下2 个条件：

a) 阴性对照、空白对照无扩增条带;

b) 相对于引物对EBOV(SZ)NP‑U 和EBOV(SZ)NP‑D，阳性对照出现预期500 bp 大小的扩增条

带;相对于引物对EBOV(BT)NP‑U 和EBOV(BT)NP‑D，阳性对照出现预期596 bp 大小的扩

增条带。

E.6.2 结果判定与报告

当同时进行的阳性对照、阴性对照、空白对照试验结果正常时，本方法检验结果判定和报告如下：

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SN/T 1439—2025

a) 均未出现预期500 bp 和596 bp 大小的扩增条带，报告“ 未检出埃博拉病毒特异性基因(常规

RT‑PCR 法)”;

b) 出现预期500 bp 扩增条带，报告“ 检出埃博拉病毒苏丹型和扎伊尔型特异性基因(常规

RT‑PCR 法)”;

c) 出现预期596 bp 扩增条带，报告“检出埃博拉病毒本迪布焦型和塔伊森林型特异性基因(常规

RT‑PCR 法)”;

判定为检出结果的样品可通过核酸序列测定进行确认。

E.7 病毒测序

对于首发病例，应将PCR 扩增产物进行序列测定，确定其碱基组成。使用BLAST 分析其与已公布

的埃博拉病毒序列的同源性，判断扩增产物是否为埃博拉病毒核酸。也可采用二代测序技术进行全基因

组测序，以确定病毒的基因型和变异情况。

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SN/T 1439—2025

附录F

(资料性)

埃博拉病毒阳性对照GenBank 参考序列编号及序列

F.1 同时检测苏丹型和扎伊尔型埃博拉病毒的阳性参考序列[EBOV(SZ)-

tem]

参考序列GenBank 编号：KT357853.1，部分特征序列如下：

GCAGAGCAAGGACTGATACAATATCCAACAGCTTGGCAATCAGTAGGACACATGAT

GGTGATTTTCCGTTTGATGCGAACAAATTTTTTGATCAAATTTCTTCTAATACACCAAG

GGATGCACATGGTTGCCGGACATGATGCCAACGATGCTGTGATTTCAAATTCAGTGGCT

CAAGCTCGTTTTTCAGGTCTATTGATTGTCAAAACAGTACTTGATCATATCCTACAAAA

GACAGAACGAGGAGTTCGTCTCCATCCTCTTGCAAGGACCGCCAAGGTAAAAAATGAGG

TGAACTCCTTCAAGGCTGCACTCAGCTCCCTGGCCAAGCATGGAGAGTATGCTCCTTTCG

CCCGACTTTTGAACCTTTCTGGAGTAAATAATCTTGAGCATGGTCTTTTCCCTCAACTGT

CGGCAATTGCACTCGGAGTCGCCACAGCCCACGGGAGCACCCTCGCAGGAGTAAATGTTG

GAGAACAGTATCAACAGCTCAGAGAGGCAGCCACTGAGGCTGAGAAGCAACTCCAACAA

TATGCGGAGGATGGGATGGATGTCAACTTTATGAGAAAAGTTCTGCGCCAACGATATGG

CGCACTGACTGCAGAACAATGGATGAGGCAGGAGATAGTGGCAATTAGGGCAG

F.2 同时检测本迪布焦型和塔伊森林型埃博拉病毒的阳性参考序列[EBOV(BT)-

tem]

参考序列GenBank 编号：KC545396.1，部分特征序列如下：

GTGGGACATATGATGGTCATCTTCAGACTAATGCGAACCAACTTCCTGATTAAGTTC

CTCCTAATACATCAGGGAATGCATATGGTTGCAGGGCATGATGCTAATGATGCCGTCAT

TGCCAACTCTGTAGCTCAAGCTCGTTTCTCCGGATTGTTGATAGTCAAAACAGTGCTTG

ATCATATCCTCCAAAAAACAGAGCACGGAGTTCGCCTGCATCCCTTGGCGCGAACAGCCA

AAGTCAAAAATGAGGTAAGCTCTTTTAAGGCCGCTTTAGCCTCACTAGCACAACATGGA

GAATATGCCCCGTTCGCTCGTCTGCTGAATCTATCTGGGGTTAACAATCTTGAGCATGG

GCTTTTCCCTCAACTTTCTGCAATTGCTTTGGGAGTAGCAACTGCACATGGGAGCACTCT

GGCAGGAGTCAATGTAGGAGAGCAATACCAACAACTGCGAGAAGCAGCCACTGAGGCCG

AAAAGCAGTTGCAGAAATATGCTGAATCTCGTGAACTTGATCACCTAGGTCTTGATGAT

CAGGAAAAGAAAATCCTAAAAGACTTCCATCAGAAAAAGAATGAGATCAGCTTCCAGCA

GACGACAGCCATGGTCACACTGCGGAAAGAGAGA