SN/T 5769-2025 十二种虾病病原恒温扩增微流控芯片检测方法

　　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T 5769—2025

十二种虾病病原恒温扩增

微流控芯片检测方法

Microfluidic chip detection of twelve shrimp pathogens —

Isothermal amplification method

2025-07-25 发布2026-02-01 实施

中华人民共和国海关总署发 布

 

前 言

本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。

本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国沈

阳海关技术中心、中华人民共和国烟台海关、复旦大学、宁波爱基因科技有限公司。

本文件主要起草人：秦智锋、吴江、孙洁、温智清、耿庆华、廖立珊、王津津、林彦星、陈兵、

阮周曦、尹伟力、刘萌、方雪恩、孔继烈。

1

十二种虾病病原恒温扩增微流控芯片检测方法

1 范围

本文件规定了虾中肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)、急性肝胰腺坏死弧菌(Vibrio

parahaemolyticus causing AHPND, VPAHPND)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectioushypodermal and

haematopoietic necrosis virus, IHHNV)、白斑综合症病毒(White spot syndrome virus, WSSV)、十足目虹

彩病毒1(Decapod iridescent virus 1, DIV1)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi, VH)、黄头病毒1(Yellow

head virus 1, YHV1)、桃拉病毒(Taura syudrome virus, TSV)、肝胰腺细小病毒(Hepatopancereatic

parvovirus, HPV)、偷死野田村病毒(Covert mortality nodavirus, CMNV)和对虾传染性肌肉坏死病毒

(Infectious myonecrosis virus, IMNV)、罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus, MrNV)

12 种虾病病原的恒温扩增微流控芯片核酸检测方法。

本文件适用于上述12 种虾病病原的检测和诊断。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文

件，仅该日期的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于

本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

GB/T 18088 出入境动物检疫采样

GB 19489 实验室 生物安全通用要求

GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫

3 术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4 缩略语

下列缩略语适用于本文件。

Bst ：嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillus stearothermophilus)

DNA ：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

DEPC ：焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate)

EDTA ：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)

FEN ：结构特异性核酸内切酶(flap structure-specific endonuclease)

RNA ：核糖核酸(ribonucleic acid)

SDS ：十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate)

Tris-HCl ：三羟甲基氨基甲烷- 盐酸[tris(hydroxymethyl)aminomethane-hydrochloric acid]

2

Tt 值：时间阈值(time threshold)

5 技术原理

针对12 种待检虾病原，从GenBank 下载核酸序列，通过序列比对找到每种病原的保守序列，针

对保守区设计合成引物。

使用微流控芯片技术， 将EHP、VPAHPND、IHHNV、WSSV、DIV1、VH、YHV1、TSV、HPV、

CMNV、IMNV 和MrNV 引物分别预先固定在微米尺度的微流控芯片相应位置后，对微流控芯片进行

封装，将待测样本与反应液(包含SYBR Green 荧光染料)混合后，加到封装好的微流控芯片中，之

后放入到带有离心功能、恒温功能及实时荧光检测一体化的微流控芯片检测仪中，利用离心力驱动样

品进入微流控芯片反应孔，进行恒温扩增。若样本中含有目的片段，则能够实现恒温扩增，扩增产物

将与荧光物质进行结合，通过荧光检测仪实时捕获荧光信号，直观反应扩增产物的产生，根据实时荧

光信号的出现时间、强度和位置，判断样本中是否含有相应的病原。

6 仪器和设备

6.1 微流控芯片检测仪。

6.2 微量点样仪。

6.3 纯水仪。

6.4 低温冷冻离心机。

6.5 恒温干燥箱。

6.6 高压锅。

6.7 漩涡振荡仪。

6.8 低温冰箱。

6.9 微量移液器(0.5 μL、2 μL、100 μL、1000 μL)。

7 试剂和材料

7.1 微流控芯片试剂组分和存放条件见附录A。除非另有说明，在检测中所用的试剂均为分析纯，

实验室用水应符合GB/T 6682 的要求。所有试剂均用无核酸酶污染的容器分装。

7.2 阴性对照、阳性对照和内参对照：

——阴性对照：从未感染目标病原的虾组织提取的核酸;

——阳性对照：从感染目标病原的虾组织提取的核酸或人工合成的含有目标核酸序列的DNA 片段;

——内参对照：包括扩增内参基因片段的引物和人工合成的内参质粒(非虾病原的基因片段)，其中

引物固定于微流控芯片反应孔中，内参质粒存在于反应液中。

7.3 反应液：20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10 mmol/L KCl，10 mmol/L( NH4)2SO4，8 mmol/L MgSO4，

0.1% Tween-20，1.4 mmol/L dNTPs，8000 U/mL Bst DNA 聚合酶，0.5 mg/mL FEN，50 μmol/L SYBR

Green 荧光染料，内参质粒(400 copies/μL)。

7.4 核酸提取试剂：可同时提取DNA 和RNA，包含蛋白酶(20 mg/mL)、磁珠(50 mg/mL)、裂解液、

异丙醇、洗液一、洗液二、洗液三和洗脱液，试剂配制方法见附录B。也可使用其他等效核酸提取试

剂或者将DNA 和RNA 分别提取的试剂。

7.5 高温反转录酶：5000 U/mL。

7.6 RNase 抑制剂：40 U/μL。

7.7 引物：12 种虾病病原检测引物序列见附录A，12 种虾病病原基因参考序列见附录C。

3

7.8 微流控芯片：5 μL/ 反应池，8×4 离心微流控芯片。可根据实际需求选择其他类型等效的商品化

微流控芯片。

7.9 耗材：封口膜、无RNase 吸头、无RNase 离心管。

8 试验方法

8.1 样品采集和处理

8.1.1 一般要求

样品的采集、保存和运输应符合GB/T 18088 的规定。样品的处理应符合GB 19489 的规定。

8.1.2 样品采集

8.1.2.1 成虾：取鳃或上皮、肝胰腺、肠、胃、游泳足或步足等病灶部位。

8.1.2.2 幼虾、仔虾、幼体或受精卵：取整体。

8.1.2.3 优先选择濒死虾或有临床症状的虾。

8.1.3 样品前处理

同一批样品，应多点采集合并后，作为一份样品进行均质，核酸提取。采样过程应快速完成，将

采取的样品放入无菌均质袋或者已灭菌1.5 mL 的离心管中，均质成糜状，加入400 μL~800 μL 无菌的

生理盐水，充分混匀，备用。

8.1.4 样品存放与运输

采集或处理的样品在2 ℃ ~8 ℃条件下保存应不超过24 h;若需长期保存，应放置于-70 ℃保存，

并且避免反复冻融(冻融不超过3 次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6 h~

8 h 之内运输到实验室。

8.2 核酸提取

8.2.1 核酸提取准备

8.2.1.1 本文件以常规核酸提取试剂(可同时提取DNA 和RNA)为例说明核酸提取步骤。实验前，

将各试剂于室温下溶解，充分混匀并短暂离心后使用。

8.2.1.2 裂解液置于56 ℃温浴至沉淀完全溶解后使用。

8.2.1.3 将蛋白酶混合物(20 mg/mL) 充分混匀后，按照每管20 μL 分装至各离心管中。

8.2.2 核酸提取步骤

8.2.2.1 向上述已加蛋白酶的离心管中加入200 μL 待提取样本，混匀;再加入400 μL 裂解液，漩涡

振荡10 s，56 ℃孵育10 min ;2 ℃ ~8 ℃ 8000 r/min 离心1 min，取上清待用。

8.2.2.2 加入300 μL 异丙醇和2 μL 磁珠，上下颠倒离心管10 次，使管内磁珠分布均匀。

8.2.2.3 静置离心管10 min，期间每隔2 min 上下颠倒离心管5 次，使管内磁珠分布均匀。

8.2.2.4 将离心管置于离心机上，2 ℃ ~8 ℃ 8000 r/min 离心1 min，用移液器吸去管内液体。

8.2.2.5 加入500 μL 洗液一，用移液器枪头轻柔打散管壁磁珠，漩涡振荡10 s，直至其分布均匀。

8.2.2.6 将离心管置于离心机上，2 ℃ ~8 ℃ 8000 r/min 离心1 min，用移液器吸去管内液体。

8.2.2.7 加入500 μL 洗液二，用移液器枪头轻柔打散管壁磁珠，漩涡振荡10 s，直至其分布均匀。

8.2.2.8 将离心管置于离心机上，2 ℃ ~8 ℃ 8000 r/min 离心1 min，用移液器吸去管内液体。

4

8.2.2.9 加入500 μL 洗液三，用移液器枪头轻柔打散管壁磁珠，漩涡振荡10 s，直至其分布均匀。

8.2.2.10 将离心管置于离心机上，2 ℃ ~8 ℃ 8000 r/min 离心1 min，用移液器吸去管内液体。

8.2.2.11 将离心管置于离心机上，2 ℃ ~8 ℃ 8000 r/min 离心30 s，用移液器吸去管内残余液体。

8.2.2.12 打开管盖，室温干燥2 min。

8.2.2.13 加入60 μL 洗脱液，用移液器枪头打散管壁磁珠，直至其分布均匀。56 ℃孵育3 min。

8.2.2.14 将离心管置于离心机上，2 ℃ ~8 ℃ 10 000 r/min 离心1 min，将收集到的上清液吸取至一个

无核酸酶的离心管中，即为纯化后的核酸溶液，作为待测模板。若需长期保存应将其放置于-70 ℃

保存。

核酸提取也可采用等效的商品化DNA 和RNA 抽提试剂盒，按照试剂盒使用说明书操作。

8.3 微流控芯片检测

8.3.1 微流控芯片的制作

将各引物配制成浓度为100 μmol/L 的储存液，分别吸取各病原引物F3、B3、FIP、BIP、LB

或LF 储存液各10 μL、10 μL、80 μL、80 μL、40 μL 于离心管中混合，加灭菌去离子水补足至

1.5 mL，涡动混匀10 s，瞬离5 s 后，即作为引物工作液，用于微流控芯片的引物包埋。微流控芯片

每反应孔添加引物工作液1.5 μL，将加好引物工作液的芯片置于37 ℃恒温干燥箱干燥30 min，确保

彻底干燥后贴上封口膜密封芯片。

8.3.2 反应体系

微流控芯片检测反应体系见表1，按表1 配制25 μL 反应体系。

表1 微流控芯片检测反应体系

序号组分名称体积/μL

1 反应液10

2 高温反转录酶0.1

3 RNase 抑制剂0.1

4 模板14.8

总反应体系25

8.3.3 加样与封片

将上述反应体系旋涡振荡混匀，瞬时离心，全部加入到微流控芯片加样孔中，用与芯片匹配的

封口膜封住加样孔，使用刮片赶走气泡，确保封口膜完全贴合。

8.3.4 恒温扩增

反应条件：反应温度63.5 ℃，反应时间30 min，每分钟采集一次荧光信号。

8.3.5 对照组的设置

8.3.5.1 阴性对照：不含目标核酸序列，单独作为一个样本，加入到加样孔中。

8.3.5.2 阳性对照：含有目标核酸序列，单独作为一个样本，加入到加样孔中。

8.3.5.3 空白对照：以DEPC 水替代核酸模板作为空白对照。

8.3.5.4 内参对照：扩增内参基因片段的引物存在于微流控芯片反应孔中，内参质粒存在于反应液

5

中，用来质控是否可以正常进行恒温扩增反应。

8.4 微流控芯片结果判断

8.4.1 微流控芯片检测仪阈值线设置

阈值线一般情况设置为800，可根据实际情况或设备情况进行调整，设定原则以阈值线刚好超过

非典型S 型扩增曲线的最高点，且时间阈值(Tt)值显示为0。判定为阳性的Tt 值设置为30。

8.4.2 质量控制

内参对照和阳性对照在Tt 值≤ 30 时，出现S 型扩增曲线，且空白对照和阴性对照无扩增曲线，

试验结果有效;否则试验无效。

8.4.3 结果判定

在微流控芯片检测仪上进行微流控芯片的恒温扩增，仪器会进行实时荧光检测，根据荧光检测

的有效扩增曲线进行判读，判定标准如下：

a)阳性：任意一个反应孔或者多个反应孔中有S 型的扩增曲线且Tt 值≤ 30，判定对应反应孔检

测指标为阳性，即该样本对应检测项目核酸阳性;

b) 阴性：任意一个反应孔或者多个反应孔中没有扩增曲线，判定对应反应孔检测指标为阴性，

即该样本对应检测项目核酸阴性。

9 生物安全措施

9.1 实验室设备、设施要求及废弃物处理应符合GB 19489 的规定。

9.2 微流控芯片的检测工作应由具备生物实验操作经验人员承担。

9.3 检验过程中防止交叉污染的措施应按照GB/T 27401 的规定执行。

6

附 录 A

(规范性)

微流控芯片检测试剂组分和存放条件以及12 种虾病病原检测引物序列

表A.1 微流控芯片试剂组分和存放条件

序号名称存放条件

1 微流控芯片-20 ℃

2 反应液-20 ℃

3 核酸裂解液室温

表A.2 肝肠胞虫引物序列

引物序列(5’→ 3’)

EHP-F3 GATGCAAAGAGATATGTTGAAAG

EHP-B3 TGCTTTAAGGTTTACAGTGTT

EHP-FIP CGCATTTTTCTGTACCTGTTTTGTT-GAATACATTCATACAAAGTTACCAG

EHP-BIP GCAGAGTGTTGTTAAGGGTTTAAGT-TGAAATTGTATTTGACCAATGGT

EHP-LB AATTACGAGTTTGGCGGCACA

表A.3 急性肝胰腺坏死弧菌引物序列

引物序列(5’→ 3’)

VPAHPND-F3 TATCATCCCGGAAGTCGG

VPAHPND-B3 GATAGAATGCATTATCAGGGC

VPAHPND-FIP CGCACCCCATTGGTATTGAAT-TAGTGTAGACATTGAGAATACGG

VPAHPND-BIP GCGGCTGGAAAGTGGCTAAA-GTTGTAAATGGTAAGTTTCATCAC

VPAHPND-LF GGTAAGCTCCCCACGTC

表A.4 传染性皮下及造血组织坏死病毒引物序列

引物序列(5’→ 3’)

IHHNV-F3 GCGACTGGAAGAGAGTGAG

IHHNV-B3 AGGTAACTCCCAAATAGGCG

IHHNV-FIP CGTTCGTCCGGAGAGTCTTCTT-TACAACATGGTACACCTTCGT

IHHNV-BIP ACAGATCATGGTGACCACTGGC-AGGATTGTAGCTCTATGTCTGG

IHHNV-LB ACATCACATACTCCGGACACC

7

表A.5 白斑综合症病毒引物序列

引物序列(5’→ 3’)

WSSV-F3 ACTAGGCTCTGACGACCT

WSSV-B3 GGCGTTCTTTTCTTCGAATGT

WSSV-FIP GGACGGGACCATTGTTGGATGT-TGGAGGAGTAGAATCAATGGAT

WSSV-BIP ACACTAATTTCCGGCAAGGCAG-AATCAAAGGCGAGAGGGC

WSSV-LB ATTCGCCTCATGCGCCAGC

表A.6 十足目虹彩病毒1 引物序列

引物序列(5’→ 3’)

DIV1-F3 TGTTAGATGGGCAGTCATG

DIV1-B3 GCATCCTTGATTGCTGGA

DIV1-FIP ACGAATCGTTTCCCGTGAGA-CAAATGCTGACGAAATCATCA

DIV1-BIP TGGGCTCGAGATTTGTTCCAAC-GCTTGTTGCAAATCATGTGTA

DIV1-LF CCCTTTAACGTTCCCGAAC

表A.7 哈维氏弧菌引物序列

引物序列(5’→ 3’)

VH-F3 AGTTGAACGTTTAAGCCCA

VH-B3 ACCAGTTTGTGTTCTTTTGTG

VH-FIP GACTGGAGCTTCATTTTCTTCCT-CTATCTTCTGAAGCAGCACTC

VH-BIP TTGATCTAGAGCAATTCGCAGAG-TAATGGTTGAGCTGTCGG

VH-LB CCCACTGCAGAGACAAAAGC

表A.8 黄头病毒1 引物序列

引物序列(5’→ 3’)

YHV1-F3 GGAGATTCCATACGGGAGA

YHV1-B3 GTGAGTGTTTCTGACGAATT

YHV1-FIP TTGTGAGGGTGTAAGACGGG-GCTCCTAAGCGTTTCTTCA

YHV1-BIP ACATCTTAATCTATCTACACACGCC-CTGTCTAACAACGTAACAGTT

YHV1-LB ACAAGTTCCTGGGCAGCT

表A.9 桃拉病毒引物序列

引物序列(5’→ 3’)

TSV-F3 TGCATTGAATCGAAGCAC

TSV-B3 AGCCGCAAAAATACCCAA

TSV-FIP CCACGTCTGTTTTCCGCTCTT-GTCAGCAGGTTTTCCCTA

8

表A.9 桃拉病毒引物序列(续)

引物序列(5’→ 3’)

TSV-BIP GCTCTGAGGAATTCATTGTTGACAA-TCCACTATGCCATCTTTGG

TSV-LB AGACACGTGTGTTTGCTGC

表A.10 肝胰腺细小病毒引物序列

引物序列(5’→ 3’)

HPV-F3 GTTTTTCCGCATGGAAGAG

HPV-B3 TGCAAAGAAACCATACAAGTT

HPV-FIP TTCGTGTACGTGGTGTTCCT-GAACCAATCAACATCAAGCT

HPV-BIP AGTTTGCTAAGAAGAAAGACGAACA-CCATCACACACAATTACCTTG

HPV-LF TGCCTTCCTCTAGTTCGT

表A.11 偷死野田村病毒引物序列

引物序列(5’→ 3’)

CMNV-F3 GGTGGGTGATTACTGTCGC

CMNV-B3 GGCTATTTACCGTCTCGGGA

CMNV-FIP TGGGCTTCTCGGAATTGCTGG-TGTATGGTGGAGCTGCGT

CMNV-BIP TGACGAATGATGGTTCCTGGCC-GGCACAAAGGACGTTGAACA

CMNV-LF CGCTTCAGTCTTACCAATTGACTTG

CMNV-LB CCAAAATGCCGCCGATAAAGA

表A.12 传染性肌肉坏死病毒引物序列

引物序列(5’→ 3’)

IMNV-F3 CAGACCTTACATCGTGCG

IMNV-B3 CTGCTGCAAGTAAAACAGAA

IMNV-FIP AAGGTGGCAGGTGTCCATAC-CCTGGACCTATCATACATAGC

IMNV-BIP ACTTTCAATACTACATCATCCCCG-TGAGCCCATATCTATTGTCG

IMNV-LF TGAACCAGTTCTTGCAAATGCA

IMNV-LB GGTAGACTGCAAGTACAAATGTCA

表A.13 罗氏沼虾诺达病毒引物序列

引物序列(5’→ 3’)

MrNV-F3 ACAACTATTCCATTGATTGTCAG

MrNV-B3 GCATGGAAAATCCACAGAC

MrNV-FIP ACACCCTGTTGAGAGAAACGAA-GATGATCAATTGTACTATACTGGTC

MrNV-BIP CTCTTGCAAGTGACTACACTACTT-CCAATCTAAATATAGTGAACCTGAA

MrNV-LB AGTGGTGAAGCCATTACAAATG

9

附 录 B

(规范性)

试剂配制

B.1 裂解液

1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0) 10 mL

0.5 mol/L EDTA(pH 8.0) 10 mL

SDS 0.50 g

盐酸胍 47.77 g

尿素 30.03 g

吐温-20 1 mL

超纯水 加至100 mL

充分溶解，室温保存。

B.2 洗液一

盐酸胍 40.12 g

异丙醇 40 mL

超纯水 加至100 mL

充分溶解，室温保存。

B.3 洗液二

NaCl 0.58 g

异丙醇 25 mL

无水乙醇 25 mL

超纯水 加至100 mL

充分溶解，室温保存。

B.4 洗液三

无水乙醇 80 mL

超纯水 加至100 mL

充分混匀，室温保存。

B.5 洗脱液

1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0) 1 mL

0.5 mol/L EDTA(pH 8.0) 0.2 mL

超纯水 加至100 mL

充分混匀，1.034×105 Pa 高压蒸汽灭菌10 min，室温保存。

10

附 录 C

(资料性)

12 种虾病病原基因参考序列(5’→ 3’)

C.1 EHP 参考序列，该片段属于孢子壁蛋白1(SWP1) 基因的部分序列。

ATGTTAGAAGATGCAAAGAGATATGTTGAAAGAAAAATTAAAAAAATTGAATACATTCATA

F3 F2

CAAAGTTACCAGAAGGTTATGAAGAAAAACAAAACAGGTACAGAAAAATGCGTGACGAA

F1C

CTAAATGTTTTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTTAAGTAATTACGAGTTTGGCGGCACAATTCT

B1C LB

CAAACATTTTCACCATTGGTCAAATACAATTTCAAACACTGTAAACCTTAAAGCATTA

B2 B3

C.2 VPAHPND 参考序列，该片段属于PirA 和PirB 基因的部分序列。

GAAGTAGACAGCAAACATACACCTATCATCCCGGAAGTCGGTCGTAGTGTAGACATTGAG

F3 F2

AATACGGGACGTGGGGAGCTTACCATTCAATACCAATGGGGTGCGCCATTTATGGCTGGC

LF F1C

GGCTGGAAAGTGGCTAAATCACATGTGGTACAACGTGATGAAACTTACCATTTACAACGC

B1C B2

CCTGATAATGCATTCTATCATCAGCGTATTGTTGTAATTAACAATGGCGCTAGTCGTGGT

B3

C.3 IHHNV 参考序列，该片段属于NS2 基因的部分序列。

CGGACGAAATGGACGGAAGGCGACTGGAAGAGAGTGAGATTGATAAACAAGTGGAAAGT

F3

ACAACATGGTACACCTTCGTCATCAGAGAAAAACCACAACCAAGAAGACTCTCCGGACG

F2 F1C

AACGCCAAACTTCACCATTACAGATCATGGTGACCACTGGCACATCACATACTCCGGACA

B1C LB

CCCAACCAATAAGACCAGACATAGAGCTACAATCCTCGCCTATTTGGGAGTTACCTTTGCTG

B2 B3

C.4 WSSV 参考序列，该片段属于capsid 蛋白基因的部分序列。

ATCTGTACCAGAAAGCGTATATGAAAACACCAAGGAAATGATTGATAGACTAGGCTCTGA

F3

CGACCTCTTCAAATCTAATAATAATGGAGGAGTAGAATCAATGGATTATGAAGATAGCGA

F2

11

AACAACATCCAACAATGGTCCCGTCCTCATCTCAGAAGCCATGAAGAATGCCGTCTATCA

F1C

CACACTAATTTCCGGCAAGGCAGCTCGCCCGGAAAATGTACCATTCGCCTCATGCGCCAG

B1C LB

CGGCCCTCTCGCCTTTGATTTCCTTCTGTCAAAGGGAGATACATTCGAAGAAAAGAACGC

B2 B3

CGAACAAGGTGCAGCAGCTGCCGTATCCTCTACCTATTCTTCCTCTTCTAACACTACTCT

C.5 DIV1 参考序列，该片段属于ATPase 蛋白基因的部分序列。

AAGGCAAACATGGGAGCTGCAAGTCCCGAATTGGCCAGGGCGGGAGATGGTGTTAGATGG

F3

GCAGTCATGGATGAACCAAATGCTGACGAAATCATCAGTTCGGGAACGTTAAAGGGTCTCA

F2 LF

CGGGAAACGATTCGTATTGGGCTCGAGATTTGTTCCAACGAGGAAAGGAAACGAAAGAAAT

F1C B1C

TATACCCTTTTTCAAATTACACATGATTTGCAACAAGCTTCCAGCAATCAAGGATGCC

B2 B3

C.6 VH 参考序列，该片段属于跨膜调节蛋白(toxR) 基因的部分序列。

CAACTGATTTGTTCAGTTGAACGTTTAAGCCCACTATCTTCTGAAGCAGCACTCACCGAT

F3 F2

GTTGATGCTCAAGAGGAAGAAAATGAAGCTCCAGTCGTTGATCTAGAGCAATTCGCAGAG

F1C B1C

CCCACTGCAGAGACAAAAGCAGAAACAGCCGTCGAACAAGCACCGACAGCTCAACCATT

LB B2

AAAATCTGCACCTGCACAAAAGAACACAAACTGGTTATTCAGAATCATCGTGTTAGTTGCC

B3

C.7 YHV1 参考序列，该片段属于糖蛋白基因的部分序列。

GATACTCCATCTGGGCCTGTAACTATCAGTGTTCTGGAAGAGTATCATGACGGAGATTCC

F3

ATACGGGAGACGGCTCCTAAGCGTTTCTTCATCTACTATCGGATAATGACAGCCCGTCTT

F2 F1C

ACACCCTCACAAGTCGAACATCTTAATCTATCTACACACGCCACAAGTTCCTGGGCAGCT

B1C LB

GAAAATTACATAAGTAACTGTTACGTTGTTAGACAGCAATTCGTCAGAAACACTCACCCA

B2 B3

C.8 TSV 参考序列，该片段属于ORF1 基因的部分序列。

CGTCAGTACATGAATGCATTGAATCGAAGCACGTCAGCAGGTTTTCCCTACAGTTCTCGCA

12

AGGCGAAAGGGAAGAGCGGAAAACAGACGTGGTTGGGCTCTGAGGAATTCATTGTTGAC

F1C B1C

AACCCGGATTTAAAAGACACGTGTGTTTGCTGCGTGGACAAGGCCAAAGATGGCATAGTG

LB B2

GATGTTAGCTTGGGTATTTTTGCGGCTACATTGAAAGATGAAAGGCGCCCATTGGAGAAA

B3

C.9 HPV 参考序列，该片段属于NS2 基因的部分序列。

TTGGGCACGTTTTTCCGCATGGAAGAGGAACCAATCAACATCAAGCTATACGAACTAGAG

F3 F2 LF

GAAGGCAAGGAACACCACGTACACGAAGCTATTCGTATTGACAGTAGTAACTCTAAGTTT

F1C

GCTAAGAAGAAAGACGAACAGGGTAATGTTTTGGATGATTTCAAGGTAATTGTGTGTGAT

B1C B2

GGAGAGAATAACTTGTATGGTTTCTTTGCAAATACACAATTAAATAAGTTGTTTAACAAA

B3

C.10 CMNV 参考序列，该片段属于RNA 聚合酶基因的部分序列。

TCGAGTTGAAGGCTATCTCGTGACAGATGCCCTTACACCATTGGTGGGTGATTACTGTCG

F3

CTCTATGATTCGATTGTATGGTGGAGCTGCGTCAAGTCAATTGGTAAGACTGAAGCGCAA

F2 LF

AACCAGCAATTCCGAGAAGCCCAATTGGTTGACGAATGATGGTTCCTGGCCCCAAAATG

F1C B1C LB

CCGCCGATAAAGATGCTATGTTCAACGTCCTTTGTGCCCGTACTCAAATTCATCCCGAGAC

B2

GGTAAATAGCCATATCGAACGCCTGGCCAACATAACTACACCTTTTGACCCTA

B3

C.11 IMNV 参考序列，该片段属于衣壳蛋白(CAP) 基因的部分序列。

CCACCTCCAGACCTTACATCGTGCGGGGACGTTGAGAGTAATCCTGGACCTATCATACAT

F3 F2

AGCGTTGCATTTGCAAGAACTGGTTCAGTATGGACACCTGCCACCTTTACTTTCAATACT

LF F1C B1C

ACATCATCCCCGGGTAGACTGCAAGTACAAATGTCATCCAGCGACAATAGATATGGGCTC

LB B2

AATTCTGTTTTACTTGCAGCAGGTGGTACAACATGGGGCACAGCTTATTTTTCACAACAT

B3

13

C.12 MrNV 参考序列，该片段属于衣壳蛋白(CAP) 基因的部分序列。

CACAAGTGGGTGCGCGACAGTGGAATTTCTCTGATACAACAACTATTCCATTGATTGTC

F3

AGGCGTGATGATCAATTGTACTATACTGGTCAAGATAAGGAGAACGTTCGTTTCTCTCA

F2 F1C

ACAGGGTGTATTTTACCTCTTGCAAGTGACTACACTACTTAATATTAGTGGTGAAGCCAT

B1C LB

TACAAATGATTTGATTTCAGGTTCACTATATTTAGATTGGGTCTGTGGATTTTCCATGCC

B2 B3

注：引物FIP 和BIP 分别通过F1C 和F2、B1C 和B2 连接。