中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 5768—2025
马鼻肺炎检疫技术规范
Quarantine protocol for equine rhinopneumonitis
2025-07-25 发布2026-02-01 实施
中华人民共和国海关总署发 布
前 言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规
定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：中华人民共和国青岛海关、中华人民共和国广州海关、中华人民共和国上海
海关、中华人民共和国乌鲁木齐海关。
本文件主要起草人：郑小龙、王群、鱼海琼、王艳、王科珂、朱来华、邓明俊、肖西志、戚一
达、辛学谦、梁成珠。
1
马鼻肺炎检疫技术规范
1 范围
本文件规定了马鼻肺炎临床诊断、病毒分离、实时荧光PCR、巢式PCR、微量血清中和试验和
ELISA 试验方法。
本文件适用于马鼻肺炎临床诊断和实验室检测等。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本
文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
GB/T 18088 出入境动物检疫采样
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
SN/T 2123 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范
SN/T 2984 检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CPE: Cytopathic effect，细胞病变。
EHV-1: Equine herpesvirus-1，马疱疹病毒1 型。
EHV-4: Equine herpesvirus-4，马疱疹病毒4 型。
ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附试验。
E. Derm 细胞: Equine derm cell，马成纤维细胞。
OD 值: Optical density，光密度值。
PBS: Phosphate buffer saline，磷酸盐缓冲液。
PCR: Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应。
实时荧光PCR: Real-time-PCR，实时荧光聚合酶链式反应。
RK-13 细胞：Rabbit kidney cell，兔肾细胞。
5 实验室生物安全要求
实验室生物安全要求应符合GB 19489 的规定，按照SN/T 2984 的规定操作相应的试验材料。
2
6 临床诊断
6.1 临床症状
马鼻肺炎是马属动物的一种急性发热性传染病，其病原体为亲缘关系密切的两种疱疹病毒——马
疱疹病毒1 型(EHV-1)和马疱疹病毒4 型(EHV-4)。由EHV-1 或EHV-4 引起的感染以原发性呼
吸道疾病为特征，其严重程度随感染动物的年龄和免疫状况而不同。EHV-1 感染还可以引起比呼吸
道黏膜炎症更严重的疾病，如流产、初生驹死亡或神经机能障碍，详见附录A 中A.2。
6.2 病理变化
马鼻肺炎患病动物的流产胎儿或神经受损动物中枢神经系统出现的组织学病变特征，可作为实
验室诊断的补充，详见附录A 中A.3。
6.3 结果判定
根据该病的临床症状、病理变化和流行病学特征作出初步诊断，进一步确诊需要进行实验室
检测。
7 实验室检测
7.1 病毒分离
7.1.1 仪器和设备
7.1.1.1 CO2 细胞培养箱: 37 ℃。
7.1.1.2 冰箱: 2 ℃～ 8 ℃、-20 ℃、-70 ℃。
7.1.1.3 倒置显微镜: 10×、20×。
7.1.1.4 生物安全柜。
7.1.1.5 恒温水浴锅: 37 ℃。
7.1.1.6 离心机。
7.1.1.7 无菌手术剪。
7.1.1.8 无菌镊子。
7.1.1.9 细胞培养瓶。
7.1.1.10 96 孔细胞培养板。
7.1.1.11 0.45 μm 无菌滤器。
7.1.1.12 微量可调移液器及配套吸头: 10 μL、100 μL、1 000 μL。
7.1.2 试剂与材料
7.1.2.1 细胞培养液: 配制见附录B 中B.1。
7.1.2.2 细胞维持液: 配制见附录B 中B.1。
7.1.2.3 运输液: 配制见附录B 中B.1。
7.1.2.4 胰酶。
7.1.2.5 MEM 液体培养基。
7.1.2.6 青霉素: 配制见附录B 中B.3。
7.1.2.7 链霉素: 配制见附录B 中B.3。
7.1.2.8 PBS(pH 7.2 ～ 7.4): 配制见附录B 中B.4。
3
7.1.2.9 RK-13 细胞。
7.1.2.10 E. Derm 细胞或原代马胎儿肾细胞。
7.1.3 样品的采集
样品的采集、保存及运输应符合GB/T 18088 和SN/T 2123 的相关要求。对无症状或出现呼吸道
症状的病例，采集鼻咽分泌液拭子置于含3 mL 运输液的10 mL 离心管中。对出现神经症状的病例，
用含EDTA 抗凝剂的采血管无菌采取10 mL ～ 20 mL 抗凝血。对病死病例，应立即无菌采集淋巴结、
肾上腺、脾、肺等组织。对有流产胎儿的病例，应无菌采集流产胎儿的肺、肝、脾和胸腺等组织。所
有样品采集后置于4 ℃条件下，立即送实验室检测，若不能立即送检，应于-20 ℃保存。
7.1.4 样品的处理
7.1.4.1 对鼻咽拭子，可将拭子连同3 mL 运输液，放入10 mL 的无菌注射器中，经0.45 μm 的无菌
滤器过滤到无菌试管中，滤液用于接种细胞。
7.1.4.2 病死马或流产胎儿的肝、肺、胸腺和脾等组织混合后剪碎，研磨成糊状，加入MEM 液
体培养基，制成10% 悬液，3 000 r/min 离心10 min，吸取上清液，加入青霉素500 IU/mL、链霉素
500 μg/mL。怀疑有细菌污染的样品，可用0.45 μm 的无菌滤器过滤处理。
7.1.4.3 对于抗凝全血，翻转试管使之混合，在室温下静置1 h，吸出含有白细胞的上层血浆，1 500
r/min 离心15 min，弃上清液，稍转动试管使白细胞悬浮于少量剩余血浆中，加入10 mL 的灭菌PBS
(pH 7.2 ～ 7.4) ，1 000 r/min 离心10 min，弃上清液，然后将白细胞悬浮于1 mL 细胞维持液中。
7.1.5 细胞培养
用细胞瓶或细胞板培养RK-13 细胞( 分离EHV-1)、E. Derm 细胞或原代马胎儿肾细胞( 分离
EHV-4)，可采用原代细胞培养或传代细胞培养。
7.1.6 样品接种
7.1.6.1 将经7.1.3 处理好的样品接种到已长满的细胞单层上，每25 cm2 细胞接种0.5 mL 样品液，或
取50 μL 接种至96 孔培养板。接种样品的细胞单层在37 ℃，5% CO2 下振荡吸附1 h，吸附后弃去接
种液，用灭菌PBS 或细胞维持液将细胞单层冲洗2遍，同时用未接种样品的细胞作空白对照。
7.1.6.2 加5 mL 细胞维持液，置于37 ℃，5% CO2 中培养。每天观察细胞病变(CPE)，连续观察5 d ～
7 d。CPE 主要呈现细胞圆缩、拉网、折光性增强和脱落。若培养后无CPE，应将细胞进行冻融，盲
传2 代。
7.1.7 结果判定
样品接种细胞后，若3 d ～ 7 d 内，细胞发生圆缩、拉网、折光性增强，直至细胞脱落、破碎，
可初判为疑似病毒分离阳性，对于初判为疑似阳性样品推荐应用巢式PCR 或实时荧光PCR 方法进行
鉴定;若盲传两代后，仍无病变则判为阴性。
7.2 实时荧光PCR
7.2.1 仪器和设备
7.2.1.1 生物安全柜。
7.2.1.2 离心机。
7.2.1.3 核酸提取仪。
4
7.2.1.4 荧光PCR 仪。
7.2.1.5 冰箱: 2 ℃～ 8 ℃、-20 ℃。
7.2.1.6 微量可调称器及配套吸头: 10 μL、100 μL、1 000 μL。
7.2.2 试剂与材料
7.2.2.1 Trizol。
7.2.2.2 TE 缓冲液(pH 8.0): 配制见附录B 中B.5。
7.2.2.3 三氯甲烷。
7.2.2.4 异丙醇。
7.2.2.5 75% 乙醇。
7.2.2.6 DNA 提取试剂盒。
7.2.2.7 荧光PCR 试剂盒。
7.2.2.8 荧光PCR 引物和探针，见表1。
表1 实时荧光PCR 引物和探针
引物/
探针名称
引物序列(5`-3`) 目标基因
上游引物GGG-GTT-CTT-AAT-TGC-ATT-CAG-ACC
下游引物GTA-GGT-GCG-GTT-AGA-TCT-CAC-AAG EHV-1 gB( 附录C.2.1.1)
探针FAM-TCT-CCA-ACG-AAC-TCG-CCA-GGC-TGT-ACC-BHQ1
上游引物CAT-GTC-AAC-GCA-CTC-CCA
下游引物GGG-TCG-GGC-GTT-TCT-GT EHV-1 gB( 附录C.2.1.2)
探针FAM-CCC-TAC-GCT-GCT-CC-MGB-NFQ
上游引物CAT-ACG-TCC-CTG-TCC-GAC-AGA-T
下游引物GGT-ACT-CGG-CCT-TTG-ACG-AA EHV-1 gB( 附录C.2.1.3)
探针FAM-TGA-GAC-CGA-AGA-TCT-CCT-CCA-CCA-CCF-A-BHQ1
上游引物TAT-ACT-CGC-TGA-GGA-TGG-AGA-CTT-T
下游引物TTG-GGG-CAA-GTT-CTA-GGT-GGT-T EHV-1 gB( 附录C.2.1.4)
探针FAM-ACA-CCT-GCC-CAC-CGC-CTA-CCG-BHQ1
上游引物GCG-GGC-TCT-GAC-AAC-ACA-A
下游引物TTG-TGG-TTT-CAT-GGG-AGT-GTG-TA EHV-1 gC( 附录C.2.1.5)
探针FAM-TAA-CGC-AAA-CGG-TAC-AGA-A-BHQ1
上游引物TAG-CAA-ACA-CCC-ACT-AAT-AAT-AGC-AAG
下游引物GCT-CAA-ATC-TCT-TTA-TTT-TAT-GTC-ATA-TGC EHV-4 gC( 附录C.2.2)
探针JOE-CGG-AAC-AGG-AAC-TCA-CTT-CAG-AGC-CAG-C-BHQ1
注:EHV-1 可任选一套引物探针。
7.2.3 样品采集
按7.1.3 的方法采集和送检样品。
5
7.2.4 样品处理
7.2.4.1 鼻咽拭子
将含运输液的鼻咽拭子样品管振荡混匀，取浸出液200 μL 用于DNA 提取。
7.2.4.2 组织样品
取组织样品1 g ～ 2 g 置于离心管内, 加入1 mL PBS(pH 7.2 ～ 7.4)进行研磨，5 000 r/min 离心
5 min，取上清液200 μL 用于DNA 提取。
7.2.4.3 抗凝血
取2 mL 抗凝血，冻融3 次，取200 μL 用于DNA 提取。
7.2.4.4 细胞培养物
取1 mL 细胞培养物，冻融3 次，取200 μL 用于DNA 提取。
7.2.5 核酸提取
7.2.5.1 取7.2.4 处理好的样品及对照200 μL 至1.5 mL 离心管，加入600 μL Trizol 溶液，剧烈振荡混
匀后，室温放置5 min。
7.2.5.2 加200 μL 三氯甲烷，盖紧盖子，剧烈摇动15 s，室温放置3 min，4 ℃、12 000 r/min 离心
15 min。
7.2.5.3 吸取上清液至新的离心管内，加入500 μL 预冷的异丙醇，上下翻转混匀，室温放置10 min。
7.2.5.4 4 ℃、12 000 r/min 离心15 min。缓慢弃上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将液体去除。
7.2.5.5 加入1 000 μL 预冷的75% 乙醇，缓慢倒转洗涤沉淀。
7.2.5.6 4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，弃上清液，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥沉淀
5 min ～ 10 min。
7.2.5.7 加入30 μL TE 缓冲液，4 000 r/min 离心5 s，室温溶解10 min。立即使用或-70 ℃保存备用。
注：病毒核酸提取也可使用等效的商品化DNA 提取试剂盒，按照说明书或使用核酸提取仪进行操作。
7.2.6 反应体系
将荧光PCR 试剂、引物探针等室温融化，2 000 r/min 离心5 s。按样品数量配置反应液，同时设
立阳性对照、阴性对照和空白对照，每个反应管包含成分见表2。
表2 实时荧光PCR 反应体系
成分 用量(μL)
2×PCR buffer 12.5
上游引物(10 pmol/μL) 1.0
下游引物(10 pmol/μL) 1.0
探针(10 pmol/μL) 1.0
DNA 模板/ 对照2.0
ddH2O 7.5
合计25.0
6
将上述扩增试剂加入到96 孔反应板中，盖紧管盖，2 000 r/min 离心30 s。
注：可采用等效的商品化荧光PCR 试剂盒进行扩增。
7.2.7 反应参数
95 ℃ 5 min ;95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。
注：反应体系、时间和温度可依据所用试剂盒的不同而适当改变。
7.2.8 结果判定与表述
7.2.8.1 质量控制
阴性对照和空白对照无Ct 值且无扩增曲线。
阳性对照Ct 值应≤ 30.0，并出现典型的扩增曲线。
否则此次实验视为无效。
7.2.8.2 结果判定
若被检样本Ct 值≤ 35，且出现典型的扩增曲线，判定为EHV-1 或EHV-4 核酸阳性。
若无Ct 值或Ct 值≥ 40，判为EHV-1 或EHV-4 核酸阴性。
若35
出现特异性扩增曲线即判为EHV-1 或EHV-4 核酸阳性，否则判为EHV-1 或EHV-4 核酸阴性。
7.2.8.3 结果表述
检测结果为阳性者，表述为“检出EHV-1 或EHV-4 核酸”。
检测结果为阴性者，表述为“未检出EHV-1 或EHV-4 核酸”。
7.3 巢式PCR
7.3.1 仪器和设备
7.3.1.1 生物安全柜。
7.3.1.2 离心机。
7.3.1.3 核酸提取仪。
7.3.1.4 PCR 仪。
7.3.1.5 冰箱: 2 ℃～ 8 ℃、-20 ℃。
7.3.1.6 微量可调称器及配套吸头: 10 μL、100 μL、1 000 μL。
7.3.2 试剂与材料
7.3.2.1 Trizol。
7.3.2.2 TE 缓冲液(pH 8.0): 配制见附录B 中B.5。
7.3.2.3 三氯甲烷。
7.3.2.4 异丙醇。
7.3.2.5 75% 乙醇。
7.3.2.6 DNA Marker。
7.3.2.7 DNA 提取试剂盒。
7.3.2.8 PCR 扩增试剂盒。
7.3.2.9 EHV-1 和EHV-4 的巢式PCR 引物序列见表3、表4。
7
表3 检测EHV-1 的巢式PCR 引物序列
PCR 反应引物序列(5`-3`) 片段大小
第一轮反应
BS-1-P1 ：TCT-ACC-CCT-ACG-ACT-CCT-TC
1 473 bp
gB1-R-2 ：ACG-CTG-TCG-ATG-TCG-TAA-AAC-CTG-AGA-G
第二轮反应
BS-1-P3 ：CTT-TAG-CGG-TGA-TGT-GGA-AT
770 bp
gB1-R-a ：AAG-TAG-CGC-TTC-TGA-TTG-AGG
表4 检测EHV-4 的巢式PCR 引物序列
PCR 反应引物序列(5`-3`) 片段大小
第一轮反应
BS-4-P1 ：TCT-ATT-GAG-TTT-GCT-ATG-CT
952 bp
BS-4-P2 ：TCC-TGG -TTG-TTA-TTG-GGT-AT
第二轮反应
BS-4-P3 ：TGT-TTC-CGC-CAC-TCT-TGA-CG
600 bp
BS-4-P4 ：ACT-GCC-TCT-CCC-ACC-TTA-CC
7.3.3 样品采集
按7.1.3 的方法采集和送检样品。
7.3.4 样品处理
按7.2.4 的方法进行样品处理。
7.3.5 核酸提取
按7.2.5 的方法进行核酸提取。
7.3.6 反应体系
检测EHV-1/EHV-4 的巢式PCR 反应体系见表5，在检测过程中同时设立阳性对照、阴性对照和
空白对照。
表5 检测EHV-1/EHV-4 的巢式PCR 反应体系
组分加样量(μL)
5×PCR Mix 5.0
上游引物(10 pmol/μL) 1.0
下游引物(10 pmol/μL) 1.0
Taq 酶(5 U/μL) 0.5
DNA 模板/ 对照或1:10 稀释的第一轮产物2.0
ddH2O 补充至反应总体积为25 μL
7.3.7 反应参数
检测EHV-1 和EHV-4 的第一轮PCR 和第二轮PCR 的反应条件均相同，反应参数均为：94 ℃
8
4 min ;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环;72 ℃ 10 min。
7.3.8 电泳
将PCR 扩增产物用1.5% 的琼脂糖凝胶进行电泳，并用DNA Marker 作对照，电泳结束后用凝胶
成像仪观察结果。
7.3.9 结果判定与表述
7.3.9.1 质量控制
若阳性对照扩增出预期大小条带，而阴性对照和空白对照未扩增出预期大小条带，判定PCR 反
应成立。
若阳性对照未扩增出预期大小条带，无论阴性对照和空白对照是否扩增出任意大小条带，均判
定PCR 反应无效。
7.3.9.2 结果判定
若被检样品在两轮PCR 反应中分别扩增出1 473 bp 条带和770 bp 条带，或在第一轮PCR 反应中
未扩增出1 473 bp 条带而在第二轮PCR 反应中扩增出770 bp 条带，则判定被检样品为EHV-1 核酸
阳性，否则判为EHV-1 核酸阴性。
若被检样品在两轮PCR 反应中分别扩增出952 bp 条带和600 bp 条带，或在第一轮PCR 反应中
未扩增出952 bp 条带而在第二轮PCR 反应中扩增出600 bp 条带，则判定被检样品为EHV-4 核酸阳性，
否则判为EHV-4 核酸阴性。
对于PCR 检测阳性的扩增产物进行序列测定和分析，如果样品序列为特异性EHV-1/EHV-4 病
毒基因序列，进一步证明结果的正确性。
7.3.9.3 结果表述
检测结果为阳性者，表述为“检出EHV-1 或EHV-4 核酸”。
检测结果为阴性者，表述为“未检出EHV-1 或EHV-4 核酸”。
7.4 微量血清中和试验
7.4.1 仪器和设备
7.4.1.1 CO2 培养箱: 37 ℃。
7.4.1.2 生物安全柜。
7.4.1.3 倒置显微镜: 10×、20×。
7.4.1.4 离心机。
7.4.1.5 恒温水浴锅: 37 ℃。
7.4.1.6 冰箱: 2 ℃～ 8 ℃、-20 ℃、-70 ℃。
7.4.1.7 微量可调移液器及配套吸头: 10 μL、100 μL、1 000 μL。
7.4.1.8 细胞培养瓶。
7.4.1.9 96 孔细胞培养板。
7.4.2 试剂与材料
7.4.2.1 EHV-1 标准毒株。
7.4.2.2 EHV-4 标准毒株。
9
7.4.2.3 EHV-1 阴、阳性血清。
7.4.2.4 EHV-4 阴、阳性血清。
7.4.2.5 RK-13 细胞。
7.4.2.6 E. Derm 细胞或原代马胎儿肾细胞。
7.4.2.7 细胞培养液: 配制见附录B 中B.1。
7.4.2.8 细胞维持液: 配制见附录B 中B.1。
7.4.2.9 运输液: 配制见附录B 中B.1。
7.4.2.10 MEM 液体培养基。
7.4.2.11 青霉素: 配制见附录B 中B.3。
7.4.2.12 链霉素: 配制见附录B 中B.3。
7.4.2.13 PBS (pH 7.2 ～ 7.4): 配制见附录B 中B.4。
7.4.2.14 胰酶。
7.4.3 样品采集与处理
采集5 mL 血液于无菌真空采血管内，分离血清后分装，冷藏(检测 )或冷冻(留样)保存。试
验前将血清样品置于56 ℃水浴中灭活30 min。
7.4.4 微量血清中和试验
7.4.4.1 病毒滴度测定
在16 孔细胞培养板上加8 孔无血清MEM 液体培养基，每孔加900 μL，吸取100 μL 病毒原液
于第1 孔，吹打均匀后吸取100 μL 移至第2 孔，依次稀释至第8 孔，孔中液体即为稀释好的10-1 至
10-8 稀释度的病毒液。在96 孔细胞培养板上第1 列至第8 列每孔加25 μL 无血清MEM 液体培养基，
分别将16 孔细胞培养板上稀释好的10-1 至10-8 稀释度的病毒液按顺序对应加至96 孔培养板第1 列
至第8 列上，每孔25 μL ;再加入100 μL RK-13 细胞(EHV-1) 或E-Derm 细胞(EHV-4)(2.5×105
细胞/mL)悬液于各孔中，同时设正常细胞对照，置5% CO2 培养箱37 ℃培养，每天观察CPE，96 h
终判出现CPE 的孔数，然后根据Kǎrber 法计算病毒效价。
7.4.4.2 中和试验
7.4.4.2.1 在96 孔细胞培养板上每孔加25 μL 无血清MEM 液体培养基。
7.4.4.2.2 加25 μL 血清样品于A 行(血清毒性对照)和B 行孔内，从B 行开始作倍比稀释至第H 行;
同一血清加两孔做平行试验，每个96 孔细胞培养板可检测6 份血清，中和试验样品布局图见表6。
7.4.4.2.3 除A 行血清对照外，每孔加入25 μL 适当稀释的(100 TCID50/ 孔)EHV-1 或EHV-4 病毒液，
加入病毒液后血清的稀释度为1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 256。
7.4.4.2.4 同时设立阴性血清对照、阳性血清对照、细胞对照( 无病毒)、病毒对照( 将工作浓度的病
毒作100、10-1、10-2、10-3 稀释)，中和试验对照布局图见表7。
7.4.4.2.5 置于5% CO2 培养箱中37 ℃孵育1 h。
7.4.4.2.6 每孔加100 μL 用MEM 细胞培养液配制好的RK-13 或E-Derm 细胞悬液(2.5×105 细胞/mL)。
7.4.4.2.7 置于5% CO2 培养箱中37 ℃孵育4 d ～ 5 d。
7.4.4.2.8 在显微镜下观察CPE，记录实验结果。
7.4.4.3 结果判定与表述
7.4.4.3.1 质量控制
细胞对照、阳性血清对照和血清细胞毒性对照孔应无CPE，阴性对照血清应出现CPE，同时每孔
10
加入的病毒量应在101.5 ～ 102.5 TCID50 之间，则试验成立，反之则试验无效。
表6 中和试验样品布局图
表7 中和试验对照布局图
7.4.4.3.2 结果判定
若细胞单层未见CPE，判定为中和试验阳性;病毒完全被中和(无CPE)的血清最高稀释度为
该血清的终点滴度。
若细胞单层出现CPE，判定为中和试验阴性。
微量血清中和试验主要基于急性期和恢复期双份血清的抗体效价是否显著上升(4 倍或以上)。
出现临诊症状(急性期)时应尽快采血，作为第一份血样，2 周～ 4 周后(恢复期)采集第二份血样。
对比急性期和恢复期的两份血清抗体效价，若效价升高4 倍及以上，则判定为中和试验阳性。
7.4.4.3.3 结果表述
中和试验为阳性者，表述为“EHV-1 或EHV-4 抗体阳性”。
中和试验为阴性者，表述为“EHV-1 或EHV-4 抗体阴性”。
11
7.5 ELISA 试验
7.5.1 仪器和设备
7.5.1.1 酶标仪。
7.5.1.2 洗板机。
7.5.1.3 培养箱: 37 ℃、25 ℃ 。
7.5.1.4 单道微量可调移液器和8 道微量可调移液器及配套吸头: 10 μL、100 μL、1 000 μL。
7.5.1.5 可拆96 孔酶标板。
7.5.1.6 一次性加样槽。
7.5.2 试剂和材料
7.5.2.1 EHV-gD 重组抗原或全病毒抗原。
7.5.2.2 HRP 标记的羊抗马IgG。
7.5.2.3 EHV-1 阴、阳性对照血清。
7.5.2.4 EHV-4 阴、阳性对照血清。
7.5.2.5 包被缓冲液: 配制见附录B 中B.6。
7.5.2.6 洗涤液: 配制见附录B 中B.7。
7.5.2.7 封闭液: 配制见附录B 中B.8。
7.5.2.8 稀释液: 配制见附录B 中B.4。
7.5.2.9 底物溶液: 配制见附录B 中B.9。
7.5.2.10 终止液: 配制见附录B 中B.10。
7.5.3 检测程序
7.5.3.1 抗原包被
用包被液将重组抗原或全病毒抗原稀释至指定工作浓度，加入到酶标板中，每孔100 μL，4 ℃冰
箱过夜。
7.5.3.2 洗涤
取出酶标板甩去液体，并在洁净的吸水纸上轻拍干，每孔加入300 μL 洗涤液，甩去孔内洗涤液，
在洁净的吸水纸上轻拍干，如此重复洗3 次;也可用洗板机进行洗涤。
7.5.3.3 封闭
每孔加封闭液200 μL，37 ℃作用2 h±5 min ;按照7.5.3.2 所述方法进行洗涤。
7.5.3.4 待检样品处理
取新鲜血液放于离心管中，静置，待血液凝固后，3 000 r/min 离心5 min，所得上清液即为血清，
小心吸出上清液备用。
7.5.3.5 加样
用稀释液1:100 稀释待检血清。取稀释好的待检血清和阴性对照血清、阳性对照血清分别加入酶
标板，每份样品做两孔，每孔100 μL，轻轻混匀酶标板后置于37 ℃孵育1 h±5 min。
12
7.5.3.6 洗板
按7.5.3.2 步骤洗涤5 次。
7.5.3.7 加酶标结合物
每孔加入100 μL 酶标结合物，轻轻混匀后置于25±2 ℃孵育30 min。
7.5.3.8 洗板
按7.5.3.2 步骤洗涤5 次。
7.5.3.9 显色
每孔加100 μL 底物溶液，25±2 ℃避光显色15 min。
7.5.3.10 终止
每孔加入100 μL 终止液。
7.5.3.11 结果读取
加终止液后在10 min 之内，用酶标仪在405 nm 波长下测定OD 值。
7.5.3.12 结果计算
按公式(1)计算被检样品的S/P 值。
样品平均OD值-阴性对照平均OD值
S/P值=
阳性对照平均OD值-阴性对照平均OD值
… ………………(1)
7.5.3.13 质量控制
若阳性对照OD 值> 1.0，阴性对照OD 值< 0.3，则试验成立，可进行结果判定，反之试验无效。
7.5.3.14 结果判定
若被检样品S/P 值≥ 0.3，判为“马鼻肺炎抗体阳性”。
若被检样品S/P 值< 0.3，判为“马鼻肺炎抗体阴性”。
也可选用商品化试剂盒，按照使用说明书进行操作和结果判定。
8 综合判定
8.1 根据临床症状和病理变化可作出初步诊断，进一步确诊需要结合上述一种或两种实验室检测
结果。
8.2 对于未接种过疫苗的动物，经任何一种实验室检测方法进行检测，阳性结果时均可最终判定为
阳性。
8.3 对于接种疫苗并在疫苗免疫期内的动物，当经病毒分离或巢式PCR 或实时荧光PCR 进行检测，
结果呈阳性时，可终判为阳性;当经血清学试验进行检测，结果呈阳性时，应间隔14 天重新采样进
行确认，若经中和试验检测抗体效价升高4倍及以上时，可判定为EHV-1 或EHV-4 感染，也可采
用病毒分离或巢式PCR 或实时荧光PCR 方法进行确认。
13
附 录 A
(资料性)
临床诊断
A.1 流行病学
马鼻肺炎由马疱疹病毒1 型(EHV-1)和马疱疹病毒4 型(EHV-4)引起的一种急性发热性传
染病的统称。EHV-1/4 属于疱疹病毒科α 疱疹病毒亚科的成员。病毒有囊膜呈球形或不规则球形，
大小为120 nm ～ 200 nm，为DNA 病毒。病马和恢复后的带毒马是本病的主要传染源，病毒存在于
病马的鼻汁、血液和粪便中，流产马的胎膜、胎液和胎儿组织中也含有大量的病毒。该病主要通过呼
吸道传播，也可通过消化道或交配传染。EHV-1/4 广泛分布于世界马群中，呈地方性流行，多发生
于秋冬和早春季节，感染后以原发性呼吸道疾病为特征，对养马业危害严重。
A.2 临床症状
A.2.1 呼吸型 潜伏期2 d ～ 4 d，个别的可达1 周。EHV-1 和EHV-4 都可引起此类病症。常见的
临床症状是鼻肺炎，病驹体温升高达39.5 ℃～ 41 ℃，流多量浆液乃至粘脓性鼻汁，鼻部粘膜和眼结
膜充血。在体温升高的同时，白细胞数量减少。病程可持续1 周～ 3 周。幼驹有时发生病毒性支气管
肺炎。继发细菌感染后可导致更大经济损失。但多数病例呈隐性型感染，往往不被察觉。近年，年轻
成年马出现了一种新的散发性EHV-1 感染，病毒的主要靶细胞是肺腑的内皮细胞，严重感染的马匹
因呼吸道疾病死亡。
A.2.2 流产型 EHV-1 是一种重要的流产病原，潜伏期长短不一，为9 d 至4 个月之间。怀孕母马
的感染常不被察觉，有时出现腿部肿胀，食欲减退。怀孕母马突然发生不明原因的流产，无胎衣滞留
现象。在妊娠期的前6 个月流产的胎儿常发生自溶现象，有些接近临产期的母马被感染后，胎儿产出
时即呈昏睡状，虚弱不能站立吮乳，有黄疸和呼吸道症状，常在数天内死亡。EHV-4 仅偶尔引发流
产。成年马或妊娠马患病后，临床表现远较幼驹轻微，仅个别病马有一过性体温升高。
A.2.2 神经型 EHV-1 偶尔引起马的神经系统疾病，并有逐渐增多的趋势。所有年龄的马均可感染，
以妊娠母马和哺乳母马易感。潜伏期6 d ～ 10 d。自然感染EHV-1 引发的神经系统疾病与流产和呼
吸道疾病有关，常无前驱症状。感染马的症状表现不一，有的出现轻度的运动失调，有的则呈现严重
的神经症状，表现为前肢、后肢和腰部僵硬麻痹以至瘫痪不能起立，尾巴和膀胱失禁，会阴部痛觉减
退或消失。轻度感染马很快趋于稳定，在数天或数周内完全恢复。感染严重的马匹不能站立，常因继
发感染而死亡或被扑杀，完全恢复的可能性极小。
A.3 病理变化
A.3.1 呼吸型 剖检时主要见全身各粘膜潮红、肿胀和出血，肝脏、肾脏及心脏呈实质变性，脾脏
及淋巴结呈中度肿胀等败血性变化。气管、胃和小肠的粘膜皱壁中有胶冻样物质，肠道淋巴滤泡和肠
系膜淋巴结肿大，偶尔出现浅表性烂斑或较深的溃疡。少数病例可见支气管肺炎，呈现支气管及肺泡
上皮增生、坏死及脱落。幼龄马在整个上呼吸道粘膜出现明显的疱疹性病变。组织学观察，可见呼吸
道上皮细胞和淋巴结生发中心颗粒变性和/ 或坏死，并可见典型的A 型嗜伊红核内包涵体。
A.3.2 流产型 早期流产胎儿发生严重自溶，后期流产胎儿具有特征性病理变化。体表外观新鲜，
14
皮下常有不同程度的水肿和出血，可视粘膜黄染。心肌出血，肺水肿、胸腔积液、腹水增量，脾脏肿
大。 肝脏表面散在针尖大到粟粒大灰黄色坏死灶。 流产胎儿的胎衣不见明显变化、呈黄疸色。组织
学观察，肝脏、肺脏坏死区周围、病变肾小球、肠上皮和心肌等可见A 型嗜伊红核内包涵体。新生
幼驹的主要病理变化为间质肺炎、肺气肿和/ 或肺水肿。 组织学观察可见广泛的胸腺实质坏死，胸腺
和脾脏的淋巴细胞减少。
A.3.3 神经型 在中枢神经系统通常无眼观病变，偶尔可见脑膜、脑实质及脊髓散在局灶性出血。
组织学观察，中枢神经系统中出现脉管炎、充血、血栓和继发性肌肉颗粒变性。
15
附 录 B
(规范性)
溶液配制
B.1 细胞培养液、细胞维持液和运输液
MEM 液体培养基，0.22 μm 滤膜过滤除菌，分装成小瓶，4 ℃保存备用。
细胞培养液：含10% 灭能的犊牛血清的MEM 液体培养基, 使用时加1% 抗生素贮存液( 终浓度
为每毫升含100 IU 青霉素和100 μg 链霉素)。
细胞维持液：含2% 灭能的犊牛血清的MEM 液体培养基, 使用时加1% 抗生素贮存液( 终浓度为
每毫升含100 IU 青霉素和100 μg 链霉素)。
运输液：无菌PBS 或含1% 抗生素贮存液( 终浓度为每毫升含100 IU 青霉素和100 μg 链霉素) 的
MEM 液体培养基。
B.2 细胞消化液
胰酶 2.5 g
乙二胺四乙酸二钠(EDTA) 0.2 g
无钙镁PBS 1 000 mL
充分溶解混匀，分装成小瓶，121 ℃高压灭菌30 min 后，置-20 ℃保存备用，短期使用可4 ℃
保存。
B.3 抗生素贮存液
用灭菌双蒸水配成每毫升含10 000 IU 青霉素和10 mg 链霉素的抗生素贮存液，用微孔滤膜(0.22
μm) 过滤除菌，分装成2 mL/ 瓶，-20 ℃冻存备用。保存期不超过60 天。
B.4 磷酸盐缓冲液(PBS)
Na2HPO4.12H2O 2.90 g
KH2PO4 0.2 g
NaCl 8.0 g
KCl 0.2 g
先加适量的双蒸水，完全溶解后加双蒸水定容至1 000 mL，pH 为7.2 ～ 7.4。
B.5 TE 缓冲液(pH 8.0)
10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1 mmol/L EDTA(pH 8.0)。
B.6 包被缓冲液(PH 9.6)
NaHCO3 1.46 g
16
Na2CO3 0.97 g
H2O 500 mL
溶解后置于4 ℃冰箱。
B.7 洗涤液 (PBS-T)
PBS 1 000 mL，吐温-20 (Tween-20) 0.5 mL，混匀。
B.8 封闭液
PBS 100 mL，加入牛血清白蛋白5 g，溶解混匀。
B.9 底物溶液
B.9.1 底物缓冲液: 0.2 M Na2HPO4 (28.4 g/L) 25.7 mL, 0.2 M 柠檬酸(19.2 g/L) 24.3 mL，加蒸馏水
50 mL。
B.9.2 ABTS 使用液: ABTS 0.5 mg, 底物缓冲液 1mL，3% H2O2 2 μL，溶解混匀。
B.10 终止液：2 mol/L 硫酸
浓硫酸 22.2 mL
水 177.8 mL
17
附 录 C
(资料性)
巢式PCR 及实时荧光PCR 扩增参考序列
C.1 巢式PCR 参考序列
C.1.1 EHV-1 PCR 参考序列
TCTACCCCTACGACTCCTTCGCCCTGTCCACCGGTGATATTGTGTACGCGTCTCCGTTTTACGGCCTG
AGGGCTGCCGCTCGCATAGAGCACAATAGCTACGCGCAGGAGCGTTTCAGGCAAGTTGAAGGGTACAGG
CCCCGCGACTTAGACAGTAAACTACAAGCCGAAGAGCCGGTTACCAAAAATTTTATCACTACCCCGCATG
TCACCGTCAGCTGGAACTGGACCGAGAAGAAAGTCGAGGCGTGTACGCTGACCAAATGGAAAGAGGTCG
ACGAACTCGTCAGGGACGAGTTCCGCGGGTCCTACAGATTTACTATTCGATCCATCTCGTCTACGTTTATC
AGTAACACTACTCAATTTAAGTTGGAAAGTGCCCCCCTTACTGAATGTGTATCCAAAGAAGCAAAGGAAG
CCATAGACTCGATATACAAAAAGCAGTACGAGTCTACGCACGTCTTTAGCGGTGATGTGGAATATTACCT
GGCACGCGGGGGGTTCTTAATTGCATTCAGACCTATGCTCTCCAACGAACTCGCCAGGCTGTACCTGAAC
GAGCTTGTGAGATCTAACCGCACCTACGACCTAAAAAATCTATTGAACCCCAATGCAAACAATAACAATA
ACACCACGCGAAGACGCAGGTCTCTCCTGTCAGTACCAGAACCTCAGCCAACCCAAGATGGTGTGCATA
GAGAACAAATTCTACATCGCTTGCACAAACGAGCAGTGGAGGCAACGGCAGGTACCGATTCTTCCAACG
TCACCGCCAAACAGCTGGAGCTCATCAAAACCACGTCGTCTATCGAGTTTGCCATGCTACAGTTTGCATA
CGATCACATCCAATCCCACGTCAATGAAATGCTAAGTAGAATAGCAACTGCGTGGTGTACCCTCCAAAAC
AAAGAGCGGACCCTATGGAACGAAATGGTGAAGATTAACCCGAGCGCCATAGTCTCCGCAACCCTTGAC
GAGCGAGTTGCAGCGAGGGTCCTGGGGGACGTGATAGCTATAACGCACTGCGCCAAAATAGAGGGCAAC
GTGTACTTGCAAAACTCCATGCGCTCGATGGACAGTAACACGTGCTACTCCCGCCCCCCCGTAACATTTA
CAATTACTAAGAATGCAAACAACAGAGGGTCGATAGAAGGCCAGCTGGGAGAGGAGAACGAGATTTTC
ACGGAGCGCAAGCTGATCGAGCCGTGCGCCCTCAATCAGAAGCGCTACTTTAAGTTTGGCAAAGAGTAC
GTTTACTACGAGAACTACACGTTCGTCCGCAAAGTGCCCCCCACGGAAATCGAGGTTATCAGCACGTACG
TTGAACTAAACTTGACCCTTTTGGAAGACCGCGAGTTTCTGCCCCTGGAGGTGTACACGCGGGCTGAGCT
GGAGGACACCGGCCTGCTAGACTACAGCGAAATACAGCGCCGCAACCAGCTCCACGCTCTCAGGTTTTAC
GACATCGACAGCGT
C.1.2 EHV-4 PCR 参考序列
TCTATTGAGTTTGCTATGCTACAGTTTGCATACGATCACATCCAATCCCACGTTAATGAGATGCTAAG
TAGGATAGCAACTGCGTGGTGTACACTACAAAACAAAGAGCGGACCCTCTGGAATGAGATGGTAAAGGT
TAACCCAAGCGCTATTGTTTCCGCCACTCTTGACGAGCGAGTTGCGGCAAGGGTTTTGGGAGACGTTATA
GCCATAACACATTGTGTAAAAATAGAGGGCAATGTGTACTTACAAAACTCTATGCGCTCCTCGGACAGCA
ACACGTGCTACTCCCGCCCACCTGTAACGTTTACCATTACTAAAAATGCAAACAGCAGAGGGACGATAGA
GGGCCAGTTGGGAGAAGAAAACGAGGTTTATACGGAGCGCAAGCTTATCGAGCCGTGCGCTATCAATCA
AAAACGATACTTTAAGTTTGGCAAAGAGTATGTTTACTATGAGAACTACACGTACGTTCGCAAAGTGCCC
CCGACTGAAATCGAAGTGATCAGCACCTACGTTGAACTAAACTTAACTCTTTTGGAAGACCGCGAGTTTC
TACCCCTGGAGGTTTACACGCGAGCTGAGCTTGAAGACACGGGGCTATTGGATTACAGCGAGATACAGC
GCCGTAACCAGCTTCACGCCCTCCGATTCTACGATATAGACAGCGTTGTCAACGTGGACAACACTGCTGT
CATTATGCAGGGAATTGCCACCTTTTTTAAAGGCCTTGGTAAGGTGGGAGAGGCAGTTGGGACGCTTGTA
18
CTTGGAGCGGCTGGCGCGGTTGTTTCTACAGTATCGGGTATAGCCTCATTTATAAACAACCCATTTGGGG
GGCTCGCAATAGGCCTGTTGGTAATTGCGGGCTTAGTGGCTGCGTTTTTTGCCTACCGGTATGTAATGCAA
CTGCGCAGCAACCCCATGAAAGCTCTATACCCAATAACAACCAGGA
C.2 实时荧光PCR 参考序列
C.2.1 EHV-1 荧光PCR 参考序列
C.2.1.1 GGGGTTCTTAATTGCATTCAGACCTATGCTCTCCAACGAACTCGCCAGGCTGTACCTGAACGAG
CTTGTGAGATCTAACCGCACCTAC
C.2.1.2 CTGTCAACGCACTCCCATGGGACAGTAGACCCTACGCTGCTCCCCACAGAAACGCCCGACCC
C.2.1.3 CATACGTCCCTGTCCGACAGATACAATGACAGGGTTCCGGTTTCGGTGGAGGAGATCTTCGGT
CTCATCGACAGTAAGGGAAAATGTTCGTCAAAGGCCGAGTACC
C.2.1.4 TATACTCGCTGAGGATGGAGACTTTTACACCTGCCCACCGCCTACCGGATCCACCGTCGTACGC
ATCGAACCACCTAGAACTTGCCCCAA
C.2.1.5 TTGTGGTTTCATGGGAGTGTGTAGATTCTGTACCGTTTGCGTTAGTTGTGTTGTCAGAGCCCGC
C.2.2 EHV-4 荧光PCR 参考序列
TAGCAAACACCCACTAATAATAGCAAGCAGGCTGGCTCTGAAGTGAGTTCCTGTTCCGTTTGCGGCG
CATATGACATAAAATAAAGAGATTTGAGC
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