SN/T 5772-2025 熊蜂孢子虫鉴定技术规范

　　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T 5772—2025

熊蜂孢子虫鉴定技术规范

Identification protocol for Apicystis bombi

2025-07-25 发布2026-02-01 实施

中华人民共和国海关总署发 布

 

前 言

本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规

定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。

本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中华人民共和国长春海关、中华人民共和国潍坊

海关、中华人民共和国杭州海关。

本文件主要起草人：张体银、宋战昀、黄嫦娇、郑腾、郑晖、田国宁、何永强、李宋钰、王武

军、张志灯、于师宇。

 

1 范围

本文件规定了熊蜂孢子虫的形态学、PCR 和荧光PCR 检测方法。

本文件适用于熊蜂孢子虫的实验室鉴定。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文

件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适

用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。

GB 19489 实验室 生物安全通用要求。

3 术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4 缩略语

下列缩略语适用于本文件：

Ct ：Cycle threshold，循环阈值。

CTAB ：Cetyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵。

DNA ：Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸。

dNTP ：Deoxynucleoside triphosphate，三磷酸脱氧核苷酸。

EB ：Ethidium bromide，溴化乙锭。

ITS ：Internal transcribed space，内转录间隔区。

PBS ：Phosphate buffered saline，磷酸盐缓冲溶液。

PCR ：Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应。

SDS ：Sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸钠。

TBE ：Trihydroxymethyl aminomethane-boric acid-ethylene diamine tetraacetic acid，三羟甲基氨基甲

烷- 硼酸- 乙二胺四乙酸。

TE 缓冲液：Tris-EDTA buffer，Tris-EDTA 缓冲液。

5 设备

5.1 高压灭菌锅。

5.2 样品制备仪。

2

5.3 生物显微镜：100× ～ 400×(见图A.1)。

5.4 电子天平(感量0.01 g)。

5.5 高速冷冻离心机。

5.6 PCR 仪。

5.7 荧光PCR 仪。

5.8 微量移液器(0.5 μL ～ 10 μL, 2 μL ～ 20 μL, 20 μL ～ 200 μL, 100 μL ～ 1 000 μL)。

5.9 生物安全柜。

5.10 电泳仪。

5.11 凝胶成像系统。

5.12 冰箱(2 ℃～ 8 ℃和-20 ℃)。

6 试剂

6.1 水：符合GB/T 6682 一级水的规格。

6.2 0.01 mol/L(pH7.2)PBS，配制方法见附录B 中的B.1。

6.3 TE 缓冲液，配制方法见附录B 中的B.2。

6.4 10% SDS 溶液，配制方法见附录B 中的B.3。

6.5 蛋白酶K。

6.6 5 mol/L 的NaCl 溶液，配制方法见附录B 中的B.4。

6.7 CTAB/NaCl 溶液，配制方法见附录B 中的B.5。

6.8 三氯甲烷/ 异戊醇混合液，配制方法见附录B 中的B.6。

6.9 酚/ 三氯甲烷/ 异戊醇混合液，配制方法见附录B 中的B.7。

6.10 10×PCR 缓冲液。

6.11 dNTPs(含dCTP、dGTP、dATP、dTTP)。

6.12 Taq DNA 聚合酶。

6.13 琼脂糖。

6.14 0.5×TBE 缓冲液，配制方法见附录B 中的B.8。

6.15 核酸凝胶染料。

6.16 DNA 相对分子质量标准品。

6.17 DNA 纯化回收试剂盒。

7 生物安全措施

实验室检测条件应符合GB 19489 要求。

8 采样

8.1 采样数量

采样数量如表1 所示。

3

表1 采样数量表

蜂群数量(群) 采样数量(份) 蜂群数量(群) 采样数量(份) 蜂群数量(群) 采样数量(份)

1 1 13 13 51~57 25

2 2 14~16 14 58~67 26

3 3 17~18 15 68~80 27

4 4 19~20 16 81~99 28

5 5 21~22 17 100~126 29

6 6 23~24 18 127~170 30

7 7 25~27 19 171~256 31

8 8 28~30 20 257~495 32

9 9 31~34 21 496~4659 33

10 10 35~38 22 ≥ 4660 34

11 11 39~43 23

12 12 44~50 24

注：采样数量计算公式见附录C，也可参照其他采样规定执行。

8.2 采样方法

从每个选定蜂群中采集活力较弱的熊蜂30 只作为一份，放入烧杯内盖好，记录群号。检验前先

将活蜂用乙醚处死或置于冰箱冷冻室内冷冻10 min。

9 形态学检测

9.1 样品处理

从每份样品中随机选取10 只熊蜂，解剖取其脂肪体组织放入灭菌过的研钵中，加5 mL 0.01 mol/L

PBS 研磨成混悬液。

9.2 镜检

将处理好的组织悬液，取一滴滴至载玻片上，覆盖盖玻片，每组样品制作3 张玻片，置生物学

显微镜(400×)下观察，每张玻片观察15 个～ 20 个视野。熊蜂孢子虫的孢子呈香肠状，大小为

(11.1 μm ～ 14.4 μm)×(3.6 μm ～ 5.4 μm)(参见附录A)。

9.3 结果判定

根据镜检观察到的形态特征的符合程度可初步判定为可疑。

10 PCR 检测

10.1 引物

10.1.1 上游引物Api-F1: 5’- AGC GAT GGA TGT CTT GGG -3’。

4

10.1.2 下游引物Api-R1: 5’- TTC AGC GGG TAA CCT TGT -3’。

10.1.3 根据熊蜂孢子虫ITS 基因序列设计，扩增长度约为316 bp，用双蒸水溶解至10 μmol/L 后，

保存于-20 ℃冰箱备用。

10.2 设立对照

10.2.1 使用经过鉴定含熊蜂孢子虫的熊蜂样品或含目的片段的DNA 质粒作为阳性对照。

10.2.2 使用未感染熊蜂孢子虫的熊蜂样品作为阴性对照。

10.2.3 使用双蒸水作为空白对照。

10.3 DNA 提取

10.3.1 每组选取5 只～ 10 只处死后的熊蜂或死后新鲜的熊蜂，剖取脂肪体组织，转入2.0 mL 研磨

管中，置于样品制备仪进行研磨处理，也可直接选取可疑虫体置于样品制备仪中进行研磨处理。

10.3.2 取研磨后的样本约25 mg 转移至另一1.5 mL 离心管中，加入50 μL TE 缓冲液，使样品充分

悬浮后，加入60 μL 10% SDS 溶液和10 μL 20 mg/mL 的蛋白酶K，混匀后于37 ℃下温育1 h。

10.3.3 加入100 μL 5 mol/L 的NaCl 溶液，上下颠倒充分混匀，加入80 μL CTAB/NaCl 溶液，混匀后

65 ℃温育10 min ;加入600 μL 氯仿/ 异戊醇(体积比为24:1)，混匀后12 000 r/min 离心5 min。

10.3.4 吸取上清液至另一干净离心管，加入等体积的酚/ 氯仿/ 异戊醇(三者体积比为25:24:1)，上

下颠倒混匀，4 ℃条件下12 000 r/min 离心5 min。

10.3.5 吸取上清液至另一干净离心管，加入2 倍体积预冷的异丙醇沉淀DNA，轻轻混匀，4 ℃条件

下12 000 r/min 离心15 min，弃上清液。

10.3.6 加入600 μL 70% 预冷的乙醇洗涤沉淀，4 ℃条件下12 000 r/min 离心10 min，弃上清液，再

瞬时离心，用移液器吸除残留液体，在生物安全柜内自然风干。

10.3.7 加入20 μL TE 缓冲液溶解DNA，-20 ℃条件下保存。

10.3.8 DNA 提取也可选用等效的商品化试剂盒。

10.4 PCR 扩增

10.4.1 反应体系

普通PCR 反应体系见表2。PCR 扩增可以采用等效的商品化DNA 扩增试剂盒。

表2 普通PCR 反应体系

名称工作浓度终浓度

加样量

μL

10×PCR 缓冲液10× 1× 2.5

dNTPs 10 mmol/L 0.2 mmol/L 0.5

Taq DNA 聚合酶5 U/μL 0.1 U/μL 0.5

上游引物Api-F1 10 μmol/L 0.5 μmol/L 1.25

下游引物Api-R1 10 μmol/L 0.5 μmol/L 1.25

模板DNA/ 对照— — 2.0

水— — 17.0

总体积— — 25

注：反应体系中各试剂的量可根据反应体系总体积按比例进行调整。

5

10.4.2 反应程序

95 ℃预变性5 min ;之后95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共40 个循环;72 ℃

补充延伸10 min，4 ℃保温。

10.5 琼脂糖凝胶电泳和测序

用TBE 电泳缓冲液配制1.5% 的琼脂糖凝胶，加入使用浓度的核酸凝胶染料后进行电泳。同时使

用DNA 相对分子质量标准品作对照。电泳结束后，如在相对分子质量标准品316 bp 左右处出现DNA

条带，应用DNA 纯化回收试剂盒回收DNA 条带并进行测序，也可直接送PCR 产物进行测序。

10.6 结果判定

10.6.1 经PCR 扩增后阳性对照在316 bp 左右处出现DNA 条带，阴性对照和空白对照无条带，试验

成立。

10.6.2 待检样品核酸扩增产物电泳后，无条带或条带不在316 bp 左右处，判为熊蜂孢子虫核酸

阴性。

10.6.3 待检样品核酸扩增产物电泳后，在316 bp 左右处出现DNA 条带，则要进行测序，测序结果

同参考序列(参见附录D.1)进行比对，同源性≥ 99 % 判为熊蜂孢子虫核酸阳性，< 99 % 判为熊蜂

孢子虫核酸阴性。

11 荧光PCR 检测

11.1 引物和探针

11.1.1 上游引物Api-F2 ：5’- CGA TGG ATG TCT TGG GTC TTG -3’。

11.1.2 下游引物Api-R2 ：5’- AAA GGC ACC TTT CGC GTT C -3’。

11.1.3 TaqMan 探针qPCR-P ： 5’-FAM - TCG CAA TTT GCT GCG TTC TTC ATC GA - BHQ1-3’。

11.1.4 根据熊蜂孢子虫ITS 基因序列设计，扩增长度约为111 bp，用双蒸水溶解至10 μmol/L 后，

保存于-20 ℃冰箱备用。

11.2 设立对照

同10.2。

11.3 DNA 提取

同10.3。

11.4 荧光PCR 扩增

11.4.1 反应体系

荧光PCR 反应体系见表3。荧光PCR 扩增可以采用等效的商品化荧光PCR 试剂盒。

表3 荧光PCR 反应体系

名称工作浓度终浓度

加样量

μL

10×PCR 缓冲液10× 1× 2.0

dNTPs 10 mmol/L 0.2 mmol/L 0.4

6

名称工作浓度终浓度

加样量

μL

Taq DNA 聚合酶5 U/μL 0.1 U/μL 0.4

上游引物Api-F2 10 μmol/L 0.2 μmol/L 0.4

下游引物Api-R2 10 μmol/L 0.2 μmol/L 0.4

探针qPCR-P 10 μmol/L 0.2 μmol/L 0.4

模板DNA/ 对照— — 2.0

水— — 14.0

总体积— — 20

注：反应体系中各试剂的量可根据反应体系总体积或不同仪器的要求进行适当调整。

11.4.2 反应程序

95 ℃预变性5 min ;之后95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸30 s 收集荧光，共40 个循环。反应条

件可根据不同仪器型号和试剂盒进行调整。

11.5 结果判定

11.5.1 结果分析条件设定

综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值设定原则以阈值线刚

好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪音情况进行调整，选择FAM 通道进行

分析。

11.5.2 质量控制

阳性对照有对数扩增曲线，而且Ct 值≤ 30 ;阴性对照和空白对照无扩增曲线且无Ct 值，二者

均成立才可判定试验成立。

11.5.3 结果判定

11.5.3.1 检验样本无Ct 值时，判为熊蜂孢子虫核酸阴性。

11.5.3.2 检验样本Ct 值≤ 35 时，并且扩增曲线有明显的对数增长期，判为熊蜂孢子虫核酸阳性。

11.5.3.3 检验样本35 < Ct 值≤ 40 时，重复进行核酸提取和荧光PCR 扩增，如果Ct 值仍然≤ 40，

并且扩增曲线有明显的对数增长期，判为熊蜂孢子虫核酸阳性，否则判为熊蜂孢子虫核酸阴性。

12 综合判定

形态学检测结果可疑，PCR 和/ 或荧光PCR 方法检测为阳性，判定为检出熊蜂孢子虫。

表3 荧光PCR 反应体系(续)

7

附 录 A

(资料性)

熊蜂孢子虫

A.1 病原学

熊蜂孢子虫(Apicystis bombi，简称A. bombi)属于真核生物(Eukaryota)囊泡虫类(Alveolata)

顶复门(Apicomplexa)锥体纲(Conoidasida)簇虫亚纲(Gregarinasina)新簇虫目(Neogregarinorida)

眉囊新簇虫科(Ophryocystidae) 孢子虫属(Apicystis)。A.bombi 的孢子呈香肠状， 大小为(11.1

μm ～ 14.4 μm)×(3.6 μm ～ 5.4 μm)(固定染色后的大小)，是熊蜂微孢子虫(Nosema bombi，简称N.

bombi)的2 倍～ 3 倍，如图A.1 所示，主要寄生在熊蜂脂肪体中，也可在蜂巢的花粉及粪便中存活，

通过粪口传播方式感染其他熊蜂个体。

标引序号说明：

1——熊蜂孢子虫的成熟卵囊 ;

2——从卵囊出现的熊蜂孢子虫子孢子(标尺：5 μm)。

图A.1 光学显微镜下的熊蜂孢子虫(Plischuk 等，2011)

A.2 传播和流行

A.bombi 最初在加拿大的熊蜂中被检测到并被命名为Mattesia bombi，1996 年被重新命名为

Apicystis bombi。20 世纪 80 ～ 90 年代，在加拿大、芬兰、法国、意大利和瑞士等国的熊蜂中陆续检

测到A.bombi，近年来在北美、南美和亚洲等地区，也检测到熊蜂与蜜蜂被该寄生虫感染。A.bombi

可随着商业化熊蜂的流通进行跨种群、跨地域传播。在墨西哥和英国使用的商业化地熊蜂蜂群中，

A.bombi 的感染率均较高;在土耳其，野外收集的578 只地熊蜂蜂王的感染率为8.54% ;入侵阿根廷

巴塔哥尼亚地区的地熊蜂，感染A.bombi 的比例为12.1% ;外来物种地熊蜂携带的A.bombi 传播到本

土熊蜂中，是造成阿根廷以及南美地区熊蜂减少的主要原因。

A.3 症状及危害

感染A.bombi 的熊蜂腹部黝黑稍膨大，四处爬行，粪便呈黄色。解剖其消化道可发现，其中肠浮

肿松弛，环纹模糊，失去弹性，呈灰白色。

8

A.bombi 的危害较大，可降低蜂王滞育后的存活率，缩短工蜂寿命，增加工蜂死亡率。脂肪体是

熊蜂有关免疫和新陈代谢的生化反应的重要场所，感染A.bombi 之后，熊蜂体内储存的脂肪明显减少，

脂肪/ 脂质含量可下降17%，从而对其生理及行为造成严重影响。A.bombi 感染严重的蜂王脂肪体变

得难以辨认，异常发白，而正常蜂王脂肪体颗粒清晰可见，随着蜂王的年龄增大，脂肪体颗粒由黄色

变为褐色。

9

附 录 B

(规范性)

试剂的配制

B.1 0.01 mol/L(pH 7.2)PBS

NaCl 8.50 g

KCl 0.20 g

KH2PO4 0.20 g

Na2HPO4·12H2O 2.89 g

加蒸馏水至1 000 mL，调节pH 值至7.2，121 ℃，15 min 高压蒸汽灭菌。

B.2 TE 缓冲液

取5 mL 1 mol/L、pH 8.0 的Tris-HCl 溶液和1 mL 0.5 mol/L、pH 8.0 的Na2-EDTA 溶液，加入到

400 mL 双蒸水中，再定容至500 mL，121 ℃高压灭菌15 min。

B.3 10% SDS 溶液

在80 mL 水中加入10 g 电泳级SDS，加热至68 ℃溶解，用5 mol/L 的盐酸(HCl)调节溶液的

pH 值至7.2，加水定容至100 mL，室温保存。

B.4 5 mol/L 的NaCl 溶液

NaCl 29.3 g

蒸馏水 100 mL

溶解混匀后121 ℃高压灭菌15 min。

B.5 CTAB/NaCl 溶液

2% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，20 mmol/L EDTA-Na2，1.4 mol/L NaCl，使用前加入

0.1%(V/V)的β- 巯基乙醇。

B.6 三氯甲烷/ 异戊醇混合液

将三氯甲烷和异戊醇按24:1 的比例混合，密闭避光保存。

B.7 酚/ 三氯甲烷/ 异戊醇混合液

用1.0 mol/L Tris 饱和酚(pH 7.8±0.2)、三氯甲烷和异戊醇按25:24:1 的比例混合，密闭避光保存。

10

B.8 TBE 电泳缓冲液(5× 浓缩液)

Tris 54.0 g

硼酸 27.5 g

EDTA 2.9 g

加蒸馏水至 1 000 mL

用5 mol/L 的盐酸(HCl)调节溶液的pH 值至 8.0，或直接购买商品化的产品。

11

附 录 C

(规范性)

采样数量计算公式

采样数量计算公式见式C.1。

……………………………… (C.1)

式中：

n ——抽样个数;

CL ——置信度;

D ——群中的阳性动物数，等于群内个体数N 与预定流行率P 的乘积，即D=N×P ;

N ——为群内个体数;

Se ——检测方法的敏感性。

附 录 D

(资料性)

参考序列

D.1 普通PCR 扩增的熊蜂孢子虫ITS 基因部分序列(GenBank: KP055610.1)

1 TGGAAACAAG TCATTTTTGG AAATATTGTA AACCAAAGCA TCTGAAGAAT GAGAAAGTCG61

TAACACGGTA TCTGTAGGTG AACCTGCAGA TGGATCATTC ATATTTTAAA AAATCTATAA121

TTGAATACGT TTTTTATTTA ATTTATTAAA TAAAAAATGT AGAACAATAT AAAGTTTGTT181

CAAATATATT GATATATTGA CAACATTTTT AATAATGTTG TAAAAAAAAA AAAAAGATTG241

AGAAATATCA AATAGTTTTT TGATGTTTTT CAATTTTTTT TTTTTTTTTT TGTAATATAT301

TTAAATGTTA TATTTATGAC TATGTAAATC ATTTAATTAA AATTAAAAAA AAAATTTTTA361

GCGATGGATG TCTTGGGTCT TGTTTCGATG AAGAACGCAG CAAATTGCGA TAAGCAGTAT421

GACTTGCAAA TTTCAAAGAA TCATTAGATT TTTGAACGCG AAAGGTGCCT TTTTGCTTTA481

AGCAGTAAGG CATGTTCAGT TCAGCGCTCT TATTTATTGA ATTAATGTGT TTTCACATCT541

ATTCGTTATT AAATGCTATA ATTTTTATTA TGGCATTTTG ACTATGATAC AAAATTGATT601

ATAAGTAATA ATATATATAA TCAAATGTTT CTAATTTCAT TATGAGCCTG AGCTTGAACA661

AGGTTACCCG CTGAATTTAA GCATATTAAT AAGCGGAGGA AAAGAAACTA ACTAGGATTT721

CCTTAGTAAC GGCGAGTGAA CAGG

注1 ：下划线所示部分为引物扩增匹配区段。

D.2 荧光PCR 扩增的熊蜂孢子虫ITS 基因部分序列(GenBank: KP055610.1)

1 TGGAAACAAG TCATTTTTGG AAATATTGTA AACCAAAGCA TCTGAAGAAT GAGAAAGTCG61

TAACACGGTA TCTGTAGGTG AACCTGCAGA TGGATCATTC ATATTTTAAA AAATCTATAA121

TTGAATACGT TTTTTATTTA ATTTATTAAA TAAAAAATGT AGAACAATAT AAAGTTTGTT181

CAAATATATT GATATATTGA CAACATTTTT AATAATGTTG TAAAAAAAAA AAAAAGATTG241

AGAAATATCA AATAGTTTTT TGATGTTTTT CAATTTTTTT TTTTTTTTTT TGTAATATAT301

TTAAATGTTA TATTTATGAC TATGTAAATC ATTTAATTAA AATTAAAAAA AAAATTTTTA361

GCGATGGATG TCTTGGGTCT TGTTTCGATG AAGAACGCAG CAAATTGCGA TAAGCAGTAT421

GACTTGCAAA TTTCAAAGAA TCATTAGATT TTTGAACGCG AAAGGTGCCT TTTTGCTTTA481

AGCAGTAAGG CATGTTCAGT TCAGCGCTCT TATTTATTGA ATTAATGTGT TTTCACATCT541

ATTCGTTATT AAATGCTATA ATTTTTATTA TGGCATTTTG ACTATGATAC AAAATTGATT601

ATAAGTAATA ATATATATAA TCAAATGTTT CTAATTTCAT TATGAGCCTG AGCTTGAACA661

AGGTTACCCG CTGAATTTAA GCATATTAAT AAGCGGAGGA AAAGAAACTA ACTAGGATTT721

CCTTAGTAAC GGCGAGTGAA CAGG

注2 ：下划线所示部分为引物扩增和探针匹配区段。