T/CVMA 216-2025 写刍兽疫病毒双抗原夹心ELISA抗体检测方法

​​T/CVMA 216-2025《小反刍兽疫病毒双抗原夹心ELISA抗体检测方法》主要内容总结​​

• ​​标准性质​​：团体标准（中国兽医协会归口），编号T/CVMA 216-2025。
• ​​适用范围​​：检测羊血清中的小反刍兽疫病毒（PPRV）抗体，适用于动物疫病监测和防控。
• ​​技术原理​​：基于双抗原夹心ELISA法，通过包被抗原捕获血清中的PPRV抗体，再结合酶标抗原形成复合物，显色后通过OD值判定抗体水平。

​​（1）试剂与材料​​

• ​​关键试剂​​：
  • 重组蛋白：小反刍兽疫病毒pET-30a-(N)蛋白（包被用）和pET-32a-(NH)蛋白（酶标用）。
  • 酶结合物：HRP标记的pET-32a-(NH)蛋白。
  • 对照品：阴性对照（健康羊血清）、阳性对照（免疫羊高滴度血清）。
• ​​其他试剂​​：封闭液（含BSA和蔗糖）、洗涤液（PBS-Tween）、显色液（TMB）、终止液（硫酸溶液）等，配制方法详见附录D。

​​（2）仪器设备​​

• 酶标仪（450 nm）、恒温培养箱（37℃）、微量移液器（0.5–1000 μL）、96孔酶标板等。

​​（3）样品处理​​

• ​​采集​​：按NY/T 541规范采集羊血液，离心分离血清（无溶血、无污染）。
• ​​保存​​：短期（2–8℃）、长期（-20℃以下）。

​​（4）检测步骤​​

1. ​​样品稀释​​：血清10倍稀释后加入包被板（90 μL稀释液 + 10 μL样品）。
2. ​​孵育​​：37℃ 30分钟，洗涤3次。
3. ​​加酶结合物​​：100 μL/孔，37℃ 30分钟，洗涤3次。
4. ​​显色​​：加入TMB显色液（A+B），37℃ 15分钟。
5. ​​终止与读值​​：加终止液后，酶标仪读取450 nm OD值。

​​（5）结果判定​​

• ​​试验有效性​​：阳性对照（PC）与阴性对照（NC）OD差值≥0.4。
• ​​判定标准​​：
  • ​​阴性​​：S/P值（样品OD/PC均值）< 0.2。
  • ​​阳性​​：S/P值≥ 0.2。

• ​​附录A​​：重组蛋白制备
  • 通过大肠杆菌表达系统（pET-30a/pET-32a载体）生产N和NH蛋白，经超声破碎、镍柱纯化、透析后保存。
• ​​附录B​​：包被板制备
  • 包被抗原浓度1 μg/mL（碳酸盐缓冲液），封闭后37℃干燥保存。
• ​​附录C​​：对照血清制备
  • 阴性对照：未感染羊血清；阳性对照：疫苗免疫羊高滴度血清（效价≥1:512）。
• ​​附录D​​：试剂配制
  • 详细列出缓冲液（如包被液pH 9.6）、封闭液（含BSA和ProClin-300防腐剂）、显色液（TMB-甲醇溶液）等配方。

• ​​专利声明​​：标准可能涉及专利，但发布机构不承担识别责任。
• ​​起草单位​​：中国动物疫病预防控制中心牵头，联合多个省级疫控中心和企业。
• ​​应用意义​​：为PPRV抗体检测提供标准化方法，支持疫病净化和流行病学调查。

​​总结​​：该标准详细规范了PPRV抗体ELISA检测的全流程，涵盖试剂制备、操作步骤、结果判读及质量控制，确保检测的准确性和可重复性。