GB 31659.10-2025 食品安全国家标准 禽蛋中β-内酰胺类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

　　1　范围

本文件规定了禽蛋中青霉素V、青霉素G、氨苄西林、氯唑西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢喹肟残留量

检测的制样和液相色谱串联质谱测定方法.

本文件适用于禽蛋中青霉素V、青霉素G、氨苄西林、氯唑西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢喹肟残留量

的测定.

2　规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,

仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本

文件.

GB/T6682　分析实验室用水规格和试验方法

3　术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义.

4　原理

试样中残留的青霉素V、青霉素G、氨苄西林、氯唑西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢喹肟,经80%乙腈

水溶液提取,固相萃取柱净化浓缩,液相色谱串联质谱测定,基质匹配标准溶液内标法定量.

5　试剂与材料

除另有规定外,所有试剂均为分析纯,水为符合GB/T6682规定的一级水.

5?1　试剂

5?1?1　乙腈(CH3CN):色谱纯.

5?1?2　甲酸(HCOOH):色谱纯.

5?1?3　甲醇(CH3OH):色谱纯.

5?2　溶液配制

5?2?1　50%乙腈水溶液:取乙腈50mL,用水稀释至100mL.

5?2?2　80%乙腈水溶液:取乙腈80mL,用水稀释至100mL.

5?2?3　0?1%甲酸乙腈溶液:取甲酸1mL,用乙腈稀释至1000mL.

5?2?4　0?1%甲酸水溶液:取甲酸1mL,用水稀释至1000mL.

5?3　标准品

青霉素V、青霉素G、氨苄西林、氯唑西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢喹肟、青霉素VGD5、青霉素GD7、

氨苄西林GD5、氯唑西林G13C4、阿莫西林GD4、头孢氨苄GD5、头孢喹肟GD7 标准品,含量均≥95%,具体见附

录A.

5?4　标准溶液制备

5?4?1　标准储备液:取青霉素V、青霉素G、氨苄西林、氯唑西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢喹肟标准品各

适量(相当于有效成分约10mg),精密称定,分别用50%乙腈水溶解并稀释定容于100mL容量瓶中,配

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GB31659?10—2025

制成浓度为100μg/mL的标准储备液,2℃~8℃保存,有效期1个月.

5?4?2　内标储备液:取青霉素VGD5、青霉素GD7、氨苄西林GD5、氯唑西林G13C4、阿莫西林GD4、头孢氨苄G

D5、头孢喹肟GD7 标准品各适量(相当于有效成分约10mg),精密称定,分别用50%乙腈水溶解并稀释定

容于100mL容量瓶中,配制成浓度为100μg/mL的内标储备液,2℃~8℃保存,有效期1个月.

5?4?3　混合标准工作液:分别精密量取100μg/mL的青霉素V、青霉素G、氨苄西林、氯唑西林、阿莫西

林、头孢氨苄、头孢喹肟标准储备液各0?1mL,于100mL容量瓶中,用50%乙腈水稀释至刻度,配制成浓

度为100μg/L的混合标准工作液,临用现配.

5?4?4　混合内标工作液:分别精密量取100μg/mL 的青霉素VGD5、青霉素GD7、氨苄西林GD5、氯唑西

林G13C4、阿莫西林GD4、头孢氨苄GD5、头孢喹肟GD7 内标储备液各0?1mL,于100mL容量瓶中,用50%乙

腈水稀释至刻度,配制成浓度为100μg/L的混合内标工作液,临用现配.

5?5　材料

5?5?1　固相萃取柱:反相混合型亲水亲脂平衡共聚物固相萃取柱,200mg/6mL,或相当者.

5?5?2　微孔尼龙滤膜:0?22μm.

6　仪器和设备

6?1　液相色谱串联质谱仪:配电喷雾离子源.

6?2　分析天平:感量分别为0?00001g和0?01g.

6?3　涡旋混合器.

6?4　振荡器.

6?5　冷冻离心机:转速10000r/min.

6?6　氮吹仪.

6?7　固相萃取装置.

7　试样的制备与保存

7?1　试样的制备

取适量新鲜或冷藏的空白或供试禽蛋,去壳后混合均匀.

a)　取均质的供试样品,作为供试试样;

b)　取均质的空白样品,作为空白试样;

c)　取均质的空白样品,添加适宜浓度的标准工作液,作为空白添加试样.

7?2　试样的保存

-18℃以下保存.

8　测定步骤

8?1　提取

称取禽蛋试料(2±0?05)g,置于50mL塑料离心管,添加混合内标工作液100μL,加80%乙腈水溶

液6?0mL,涡旋混匀1min,中速振荡提取5min,4℃10000r/min离心10min,取上清液备用.

8?2　净化

将固相萃取柱安装到预先清洁过的真空萃取装置上,直接取上清液3?0mL通过小柱,保持自然流

速,收集全部流出液.40℃水浴氮吹至近干,加入水1?0mL溶解残余物,涡旋混匀,过0?22μm 微孔滤

膜,供液相色谱串联质谱测定.

8?3　基质匹配标准曲线的制备

精密量取混合标准工作液和混合内标工作液适量,用水稀释配制成青霉素V、青霉素G、氨苄西林、氯

唑西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢喹肟浓度为1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L,内标

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GB31659?10—2025

浓度为5μg/L的系列标准工作溶液,从中各取1?0mL分别加入6份经8?1提取和8?2净化的空白试料

浓缩液中,充分溶解混匀为基质匹配标准工作溶液,临用现配,微孔滤膜过滤,供液相色谱串联质谱测定.

以测试药物和其对应内标的特征离子峰面积之比为纵坐标、标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线,求回归

方程和相关系数.

8?4　测定

8?4?1　液相色谱参考条件

a)　色谱柱:C18色谱柱(150mm×2?1mm,粒径1?8μm),或相当者;

b) 柱温:30℃;

c) 进样量:10μL;

d) 流速:0?3mL/min;

e) 流动相:A 为0?1%甲酸乙腈溶液,B为0?1%甲酸水溶液,梯度洗脱程序见表1.

表1　梯度洗脱程序

时间

min

A

%

B

%

0 5 95

5?0 80 20

8?0 80 20

8?1 5 95

10?0 5 95

8?4?2　质谱参考条件

a)　离子源:电喷雾(ESI)离子源;

b) 扫描方式:正离子扫描;

c) 检测方式:多反应监测;

d) 喷雾电压:5500V;

e) 离子源温度:400℃;

f) 雾化气压力(Gas1):379kPa;

g) 辅助加热气压力(Gas2):234kPa;

h) 气帘气压力(Curtaingas):241kPa;

i) 待测药物定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞能量参考值见表2.

表2　待测药物定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞能量参考值

被测物名称

定性离子对

m/z

定量离子对

m/z

去簇电压

V

碰撞能量

eV

青霉素V 351?0>160?0

351?0>114?0 351?0>160?0 60 22

47

青霉素G 334?9>160?0

334?9>176?0 334?9>160?0 60 22

22

氨苄西林350?0>106?0

350?0>160?0 350?0>106?0 55 36

25

氯唑西林436?0>160?0

436?0>277?0 436?0>160?0 60 25

23

阿莫西林366?0>114?0

366?0>208?0 366?0>114?0 45 30

19

头孢氨苄347?9>158?0

347?9>174?0 347?9>158?0 40 18

23

头孢喹肟529?0>134?0

529?0>396?0 529?0>134?0 44 22

19

3

GB31659?10—2025

表2 (续)

被测物名称

定性离子对

m/z

定量离子对

m/z

去簇电压

V

碰撞能量

eV

青霉素VGD5 356?0>160?0 356?0>160?0 60 22

青霉素GD7 342?0>160?0 342?0>160?0 60 22

氨苄西林GD5 355?0>111?1 355?0>111?1 40 35

阿莫西林GD4 370?0>114?0 370?0>114?0 45 30

氯唑西林G13C4 440?0>160?0 440?0>160?0 60 25

头孢氨苄GD5 353?0>158?0 353?0>158?0 40 18

头孢喹肟GD7 536?0>141?0 536?0>141?0 44 47

8?4?3　测定法

8?4?3?1　定性测定

在相同测试条件下,试料溶液中βG内酰胺类药物与其相应内标的保留时间之比与基质匹配标准溶液

中βG内酰胺类药物与其相应内标的保留时间之比偏差在1%以内;且检测到的相对离子丰度应与浓度相

当的基质匹配标准溶液相对离子丰度一致,其允许偏差为±40%.

8?4?3?2　定量测定

取试料溶液和基质匹配标准溶液,做单点或多点校准,按内标法定量.基质匹配标准溶液及试料溶液

中目标物的响应值均应在仪器检测的线性范围内.在上述液相色谱串联质谱条件下,βG内酰胺类药物标

准溶液特征离子质量色谱图见附录B.

8?5　空白试验

取空白试样,除不加药物外,采用完全相同的测定步骤进行平行测定.

9　结果计算和表述

试样中βG内酰胺类药物的残留量按标准曲线或公式(1)计算.

X =

Ai ×A′is×Cs×Cis×V ×V2

Ais×As×C′is×V1×m ???????????? (1)

式中:

X ———试样中βG内酰胺类药物残留量的数值,单位为微克每千克(μg/kg);

Ai ———试料溶液中βG内酰胺类药物的峰面积;

A′is———基质匹配标准溶液中βG内酰胺类药物内标的峰面积;

Cs ———基质匹配标准溶液中βG内酰胺类药物浓度的数值,单位为微克每升(μg/L);

Cis ———试料溶液中βG内酰胺类药物内标浓度的数值,单位为微克每升(μg/L);

V ———溶解残余物所用试料溶液体积的数值,单位为毫升(mL);

V2 ———提取液总体积的数值,单位为毫升(mL);

Ais ———试料溶液中βG内酰胺类药物内标的峰面积;

As ———基质匹配标准溶液中βG内酰胺类药物的峰面积;

C′is———基质匹配标准溶液中βG内酰胺类药物内标浓度的数值,单位为微克每升(μg/L);

V1 ———用于净化过柱的提取液体积的数值,单位为毫升(mL);

m ———供试试料质量的数值,单位为克(g);

10　方法灵敏度、正确度和精密度

10?1　灵敏度

本方法青霉素V、青霉素G、氨苄西林、氯唑西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢喹肟的检出限为1μg/kg,定

量限为2μg/kg.

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GB31659?10—2025

10?2　正确度

本方法青霉素V、青霉素G、氨苄西林、氯唑西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢喹肟在2μg/kg~20μg/kg

添加浓度水平上的回收率为70%~120%.

10?3　精密度

本方法批内相对标准偏差≤20%,批间相对标准偏差≤20%.

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GB31659?10—2025

附　录　A

(资料性)

βG内酰胺类药物中英文名称、化学分子式和CAS号

βG内酰胺类药物中英文名称、化学分子式和CAS号见表A?1.

表A?1　βG内酰胺类药物中英文名称、化学分子式和CAS号

中文名称英文名称化学分子式CAS号

青霉素V钾PenicillinVPotassiumSalt C16H17N2O5SK 132G98G9

青霉素G钠PenicillinGSodiumSalt C16H17N2NaO4S 69G57G8

氨苄西林三水合物Ampicillintrihydrate C16H19N3O4S?3H2O 7177G48G2

氯唑西林钠一水合物Cloxacillinsodiumsalthydrate C19H17ClN3O5SNa?H2O 7081G44G9

阿莫西林三水合物Amoxicillintrihydrate C16H19N3O5S?3H2O 61336G70G7

头孢氨苄一水合物Cefalexinmonohydrate C16H17N3O4S?H2O 23325G78G2

硫酸头孢喹肟Cefquinomesulfate C23H25N6O5S2?HSO4 118443G89G3

青霉素VGD5 PenicillinVGD5 C16H13D5N2O5S 1356837G87G0

青霉素GD7

NG乙基哌啶盐

BenzylpenicillineGD7

NGethylpiperidiniumsalt C16H10D7N2O4S×C7H16N 1217445G37G8

氨苄西林GD5 AmpicillinGD5 C16H14D5N3O4S 1426173G65G0

氯唑西林G13C4 钠盐CloxacillinG13C4sodiumsalt C1513C4H17ClN3NaO5S 642G78G4

阿莫西林GD4 AmoxicillinGD4 C16H15N3O5SD4 26787G78G0

头孢氨苄GD5一水合物CefalexinGD5 hydrate C16H14D5N3O5S 1217541G99G5

头孢喹肟GD7 氢碘化物CefquinomeGD7 hydroiodide C23H18D7IN6O5S2 118443G88G2

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附　录　B

(资料性)

βG内酰胺类药物标准溶液特征离子质量色谱图

βG内酰胺类药物标准溶液特征离子质量色谱图见图B?1.

图B?1　βG内酰胺类药物标准溶液特征离子质量色谱图

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图B?1 (续)

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GB31659?10—2025

图B?1 (续)