T/SSESB 14-2025 基于环境DNA技术的水生入侵物种多重PCR 检测方法

以下是对团体标准 ​​T/SSESB 14-2025《基于环境DNA技术的水生入侵物种多重PCR检测方法》​​ 的详细内容总结：

​​一、标准核心内容​​

本文件规定了利用​​环境DNA（eDNA）结合多重PCR技术​​检测12种水生入侵动物的方法，包括：

• ​​罗非鱼属​​：齐氏罗非鱼、尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼、莫桑比克罗非鱼、伽利略罗非鱼
• ​​太阳鱼属​​：蓝鳃太阳鱼、绿太阳鱼
• ​​海鞘类​​：欧洲海鞘、玻璃海鞘、二段海鞘、皱瘤海鞘、柄海鞘

​​适用范围​​：湖泊、水库、河流、河口、海洋、海洋牧场、养殖塘等水域的入侵物种监测。

​​二、关键技术原理​​

1. ​​环境DNA（eDNA）​​
   • 定义：环境介质（水、沉积物等）中脱落的生物遗传物质（细胞、分泌物、残骸等释放的DNA片段）。
   • 提取流程：水样过滤→DNA富集（推荐CTAB法或商用试剂盒）→纯化保存。
2. ​​多重PCR技术​​
   • 在同一反应体系中加入多对特异性引物，同时扩增多个靶标基因片段（表1）。
   • 海鞘类检测使用​​简并引物​​（含简并碱基如R/Y/S），兼容种内序列变异。

​​三、核心检测流程​​

• 按《HJ1295》《HJ1296》布点，依《DB32/T 4539-2023》采集水样。
• ​​水样过滤​​：≥500mL水样经0.45μm滤膜真空抽滤，同步设置阴性对照（灭菌水）。

• ​​推荐方法​​：CTAB裂解→氯仿分离→异丙醇沉淀→乙醇洗涤→TE缓冲液溶解。
• ​​质控要求​​：
  • 浓度≥1ng/μL，A260/A280=1.7~2.0（紫外分光光度计检测）。
  • 分装保存于≤-20℃，避免反复冻融。

• ​​引物设计​​（详见表1）：
  • 罗非鱼：4对引物（靶向16S ribosomal、ND1-tRNA-Ile、COXI、D-loop）。
  • 太阳鱼：3对引物（均靶向D-loop区域）。
  • 海鞘：3对简并引物（靶向16S ribosomal、COXI、CYTB）。
• ​​反应体系​​（50μL）：
  • 罗非鱼：4对引物各1μL + 模板DNA 10μL + 预混液25μL。
  • 海鞘：梯度引物用量（COXI/CYTB引物2.5μL，16S引物0.5μL）。
• ​​扩增程序​​：
  • 罗非鱼/太阳鱼：95℃预变性5min → 40循环（95℃ 30s → 56.6℃ 90s → 72℃ 30s）→ 68℃延伸10min。
  • 海鞘：两阶段扩增（退火温度45℃→50℃）。

• ​​凝胶电泳​​：1~2%琼脂糖凝胶检测目标条带（阴性对照无条带，阳性对照有条带）。
• ​​测序验证​​：纯化PCR产物→高通量测序→比对附录A的参考序列确认物种。

​​四、质量控制与保证​​

1. ​​对照设置​​：
   • ​​阴性对照​​：采样、DNA提取、PCR阶段均设≥3个无菌水对照。
   • ​​阳性对照​​：已知入侵物种基因组DNA混合物（每批PCR实验1个）。
2. ​​平行样品​​：每个点位≥3个生物重复，PCR阶段≥3个技术重复。
3. ​​防污染措施​​：
   • 实验器具高温灭菌，操作在超净台进行。
   • 水样采集避免交叉污染，滤膜独立包装。

​​五、废弃物处理​​

• 生物废弃物需高压灭菌/化学灭活（含氯消毒剂500mg/L）。
• 含核酸染料的废胶/废液单独收集，按《GB19489》《SN/T4835》处理。

​​六、附录关键信息（资料性附录A）​​

• ​​提供12种入侵物种的基因扩增靶标参考序列​​（如16S、COXI、D-loop等），用于测序结果比对和物种判定。
  示例：齐氏罗非鱼D-loop序列 GAATTGCATAACTGATATCAAGAGCATAAGATT...

​​七、知识产权声明​​

• 涉及3项专利（上海海洋大学2项、中国海洋大学1项），涉及罗非鱼、太阳鱼、海鞘的引物及试剂盒。
• 专利权人承诺​​无歧视专利授权​​，联系方式见标准前言。

​​八、归口与起草单位​​

• ​​提出与归口​​：上海市环境科学学会
• ​​主要起草单位​​：上海海洋大学、上海市环境科学研究院、中国海洋大学等8家机构。
• ​​主要起草人​​：李晨虹、王玮、戚亿利等12人。

​​总结​​

该标准建立了​​高效、特异的水生入侵物种eDNA检测体系​​，通过多重PCR实现多物种同步筛查，强调全流程质控与生物安全，为水域生态风险评估提供技术支持。适用于环境监测、渔业管理及生物多样性保护领域。