T/SPPHN 003-2025 远缘杂交和基因组重排技术改良生防微生物技术规程

《T/SPPHN 003-2025 远缘杂交和基因组重排技术改良生防微生物技术规程》主要内容的详细总结：

​​核心目标：​​ 规范利用远缘杂交（原生质体融合）和基因组重排技术改良生防微生物（如提高拮抗能力、促生性等）的技术流程。

​​1. 文件基础与适用范围 (第1章 范围 & 前言)​​
* 依据标准：GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第一部分：标准的结构和起草规则》。
* 提出单位：湖南省植物保护研究所。
* 归口单位：湖南省植物保护学会。
* 起草单位：包括湖南省植物保护研究所、宁波大学、南宁汉和生物、湖南新长山等8家单位。
* 主要起草人：刘勇、张德咏等16人。
* ​​适用范围：​​ 适用于通过人工方法将不同种、属甚至更远缘的微生物细胞（以原生质体形式），通过无性融合（原生质体融合）形成杂合细胞，并利用基因组重排技术选育具有目标性状（如生防效果）的新型菌株。特别强调了对整个微生物基因组的操作。

​​2. 规范性引用文件 (第2章)​​
* ​​DB1302/T 523《平菇原生质体再生复壮技术规程》​​ 是必不可少的引用文件，其最新版本适用于本文件。

​​3. 关键术语定义 (第3章)​​
* ​​出发生防微生物菌株：​​ 待改良的原始微生物菌株。
* ​​原生质体：​​ 脱去细胞壁的植物、真菌或细菌细胞。
* ​​原生质体再生菌株：​​ 经过原生质体再生获得的遗传性状稳定的菌株。
* ​​原生质体融合：​​ 在离体条件下用人工方法将不同细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程。
* ​​融合菌株的选育：​​ 从融合产物（同源融合子、异源融合子、未融合亲本）中筛选出所需的​​异源融合子​​。
* ​​融合菌株的鉴别：​​ 通过菌落表型、拮抗试验、核型观察、生物学手段（如分子标记）及目标试验筛选传代稳定的融合子。
* ​​基因组重排技术：​​ 基于原生质体融合，进行多轮递归融合以增加细胞间基因转移频率，加速基因组改组和优良性状组合的技术。

​​4. 试剂与培养基 (第4章)​​
* 详细列出了实验所需的​​16种​​关键溶液和培养基的配方、配制方法及保存条件：
* ​​缓冲液/溶液：​​ 1 mol/L Tris-HCl (pH 7.8), 溶液A, 溶液B, 蔗糖溶液, EDTA溶液, SMM缓冲液 (用于融合和再生), PEG缓冲液 (用于融合，含40% PEG6000, CaCl₂, DMSO)。
* ​​酶：​​ 溶菌酶 (5mg/mL, -20℃保存), Dnase I (-20℃保存)。
* ​​培养基 (含基础配方、高压灭菌条件)：​​
* ​​LB系列：​​ LB液体培养基, LB固体培养基, LB高渗培养基 (含0.5mol/L蔗糖)。
* ​​光合细菌系列：​​ 光合细菌液体培养基, 光合细菌固体培养基, 光合细菌高渗液体培养基 (含0.5mol/L蔗糖), ​​光合细菌软琼脂培养基​​ (关键用于融合子再生，含琼脂8g/L, 蔗糖0.5mol/L, 灭活小牛血清200ml/L)。

​​5. 仪器与设备 (第5章)​​
* 列举了实验必需的设备：超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、冰箱/超低温冰箱、恒温摇床、台式冷冻离心机、光学显微镜、电子显微镜、紫外分光光度计、pH计、PCR仪、凝胶成像系统。

​​6. 出发菌株 (第6章)​​
* ​​明确指定了两种实验用菌株及其培养条件：​​
* ​​沼泽红假单胞菌 PSB-06：​​ 由湖南省植物保护研究所分离保存。培养于光合细菌液体培养基，​​厌氧光照​​（1500 lx，32℃），至OD660=0.9-1.0。
* ​​苏云金芽孢杆菌 KY-2：​​ 由湖南省植物保护研究所分离保存。培养于LB液体培养基，​​好氧振荡​​（30℃），至OD600=0.9-1.0。

​​7. 核心技术流程 (第7章)​​

*   **7.1 沼泽红假单胞菌PSB-06原生质体制备：**
    *   步骤：头孢噻肟钠处理 → 离心回收菌体 → 0.8M蔗糖清洗 → 溶菌酶+EDTA+Tris-HCl酶解（室温10min）→ 溶液A处理（4min）→ 溶液B稀释离心 → 重悬于光合细菌高渗培养基。
    *   检测：显微镜观察形态，计算原生质体形成率（通过蒸馏水裂解后在固体培养基上计数未形成原生质体的菌落）。

*   **7.2 苏云金芽孢杆菌KY-2原生质体制备：**
    *   步骤：SMM缓冲液洗涤 → 溶菌酶（1mg/mL）酶解（37℃震荡1h）→ 离心 → 重悬于LB高渗培养基。
    *   检测：显微镜观察形态，计算原生质体形成率（方法同7.1）。

*   **7.3 原生质体融合与再生 (初始杂交/第一轮融合)：**
    *   步骤：等量混合PSB-06和KY-2原生质体 → 加DNase I消化外源DNA（25℃ 10min）→ 离心 → 重悬于PEG缓冲液（25℃ 5-20min）→ SMM缓冲液稀释终止融合 → 离心洗涤两次 → 重悬于光合细菌高渗培养基 → 梯度稀释 → **涂布于光合细菌软琼脂再生培养基**。
    *   筛选鉴定：再生培养后，通过PCR扩增16S rDNA并测序来初步鉴定融合子 → 传代培养获得稳定融合菌株。

*   **7.4 基因组重排技术改良融合菌株 (多轮递归融合)：**
    *   **7.4.1 融合菌株原生质体制备：** 以上一步获得的融合菌株为出发菌株，调整浓度后，分别使用头孢噻肟钠（针对PSB-06特性）或高浓度溶菌酶（针对KY-2特性）处理制备原生质体，方法参照7.1和7.2。
    *   **7.4.2 融合菌株原生质体灭活：** 将制备好的融合菌株原生质体随机分为A、B两组。
        *   **A组：紫外线灭活**（30W紫外灯下照射115s，致死率达100%）。
        *   **B组：热灭活**（60℃水浴5min，致死率达100%）。
    *   **7.4.3 递归原生质体融合：**
        *   步骤：等体积混合灭活的A、B两组原生质体 → 25℃孵育30min → 离心 → 重悬于PEG缓冲液（含40% PEG6000的SMM）进行随机融合 → 离心洗涤 → 重悬于光合细菌高渗培养基 → **涂布于光合细菌软琼脂再生培养基**（30℃培养7-14天）。
        *   迭代：收集所有再生的菌落，标记为**F1代融合子菌群**。将F1代菌群作为新的出发菌株，重复 **7.4.1 (制备原生质体) → 7.4.2 (灭活) → 7.4.3 (融合再生)** 的过程，得到F2代融合子菌群。如此反复进行多轮（如F1, F2, F3...）。
    *   **7.4.4 目标融合子菌群的鉴定及筛选：**
        *   从经过多轮重排（如F2或F3）的融合子菌群中，挑选长势良好的菌株。
        *   进行**16S rDNA测序**（可能用于确认融合背景或排除污染）。
        *   进行**目标筛选试验**（如**促生试验、抗病（拮抗）试验**等），以筛选出具有改良目标性状（如更强的生防效果）的优良菌株。

​​总结要点：​​

1. ​​核心目的：​​ 规范利用​​原生质体融合（远缘杂交）​​ 和 ​​基因组重排（递归融合）​​ 技术改造生防微生物基因组，选育优良菌株。
2. ​​技术路线：​​
   • 准备两种特定出发菌株（PSB-06厌氧光能菌，KY-2好氧芽孢杆菌）。
   • ​​第一步（初始杂交）：​​ 制备各自原生质体 → 融合 → 再生 → 通过16S rDNA鉴定获得初始融合子。
   • ​​第二步（基因组重排）：​​ 将初始融合子作为新一轮的“亲本” → 制备其原生质体 → ​​分组灭活（紫外/热）​​ → ​​混合并递归融合再生​​ → 得到F1代菌群 → 重复此循环多轮（F2, F3...）→ 最终从高阶融合子中筛选目标性状优良菌株。
3. ​​关键创新点：​​ 将传统的属间原生质体融合技术与​​多轮递归融合（基因组重排）​​ 结合，并通过​​互补灭活策略​​（紫外灭活组与热灭活组融合）来提高重组效率，加速目标性状的进化与组合。
4. ​​标准化要素：​​ 详细规定了实验材料（菌株、试剂、培养基配方）、设备、各步骤的操作流程（时间、温度、浓度、离心条件等）、检测方法和筛选标准（融合率计算、16S鉴定、目标性状试验）。
5. ​​应用范围：​​ 适用于希望通过基因组工程手段快速改良生防微生物（尤其是远缘物种间杂交）的研究和开发工作。