NY/T 4657-2025 动物源伪结核棒状杆菌分离与鉴定技术规程

​​NY/T 4657-2025《动物源伪结核棒状杆菌分离与鉴定技术规程》主要内容总结​​

• ​​标准编号​​：NY/T 4657-2025
• ​​名称​​：动物源伪结核棒状杆菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）分离与鉴定技术规程
• ​​发布与实施​​：2025年1月9日发布，2025年5月1日实施。
• ​​归口单位​​：全国兽药残留与耐药性控制专家委员会。
• ​​适用范围​​：适用于动物源细菌耐药性监测中，从动物脓肿样品分离与鉴定伪结核棒状杆菌。

• 包括GB/T 6682（实验室用水）、GB 19489（实验室生物安全）、NY/T 1948（兽医实验室安全通则）、NY/T 4141（样品采集规程）等。

​​3.1 试剂与材料​​

• ​​培养基​​：需配制绵羊血琼脂（5%~10%）、脑心浸出液（BHI）培养基、小牛血清BHI琼脂（附录A）。
• ​​试剂​​：过氧化氢（3%）、PCR预混液、HCCA基质溶液（质谱用）、甘油（菌株保藏）等。
• ​​标准菌株​​：伪结核棒状杆菌ATCC 19410/CVCC 1186。

​​3.2 仪器设备​​

• 二级生物安全柜、恒温培养箱、PCR仪、电泳仪、质谱仪（MALDI-TOF MS）、生化鉴定系统等。

​​3.3 样品采集与运输​​

• 按NY/T 4141执行，2℃~8℃保存运输：
  • 无BHI肉汤的样品：运输≤24小时。
  • 含BHI肉汤的样品：运输≤48小时。

​​3.4 分离纯化​​

• ​​步骤​​：脓肿内容物划线接种绵羊血琼脂平板，36℃±1℃培养24~48小时。
• ​​菌落特征​​：乳白色、不透明、β-溶血环、边缘整齐、干燥易刮落。

​​3.5 筛查与鉴定​​

• ​​筛查​​：
  • ​​形态学​​：革兰氏阳性蓝紫色球状/短杆状，无芽孢和荚膜。
  • ​​触酶试验​​：阳性（加3%过氧化氢产生气泡）。
• ​​鉴定方法​​（三选一）：
  1. ​​生化鉴定​​：使用微生物生化鉴定系统，参考附录B.1的生化反应结果（如葡萄糖、麦芽糖阳性，海藻糖阴性等）。
  2. ​​PCR鉴定​​：
     • ​​引物​​：16S rRNA基因（1356 bp）。
     • ​​条件​​：94℃预变性5分钟，35个循环（94℃ 30秒→55℃ 30秒→72℃ 50秒）。
     • ​​结果​​：电泳确认1356 bp条带，测序相似度≥99%。
  3. ​​质谱鉴定​​（MALDI-TOF MS）：
     • 菌体经甲酸-乙腈提取后点靶，与标准菌株谱图比对（附录C）。

​​3.6 菌株保藏​​

• ​​方法​​：甘油（终浓度20%~40%）或磁珠保存管，-20℃以下冻存；或冻干（5%蔗糖脱脂乳保护剂）。

​​3.7 生物安全​​

• 符合GB 19489和NY/T 1989要求，包括废弃物处理、人员防护等。

• ​​附录A（规范性）​​：培养基配制方法（如绵羊血琼脂、BHI培养基）。
• ​​附录B（资料性）​​：
  • B.1：生化鉴定表（如葡萄糖+/海藻糖-）。
  • B.2：PCR电泳图（1356 bp条带示例）。
  • B.3：16S rRNA基因测序序列。
• ​​附录C（资料性）​​：伪结核棒状杆菌标准质谱图。

• ​​技术流程​​：样品采集→分离纯化→形态学/触酶筛查→生化/PCR/质谱鉴定→菌株保藏。
• ​​鉴定关键​​：β-溶血菌落、革兰阳性棒状、触酶阳性、PCR扩增1356 bp片段或质谱匹配。
• ​​安全与质量控制​​：全程生物安全规范，标准菌株对照确保结果可靠性。

该标准为动物源伪结核棒状杆菌的实验室检测提供了标准化操作指南，适用于兽医诊断和耐药性监测。