NY/T 4656-2025 动物源产气芙膜梭菌分离与鉴定技术规程 ,该文件为pdf格式 ,请用户放心下载!
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资源简介
《NY/T 4656-2025 动物源产气荚膜梭菌分离与鉴定技术规程》主要内容总结
1. 标准概述
- 标准名称：动物源产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）分离与鉴定技术规程。
- 适用范围：适用于动物直肠/泄殖腔拭子、新鲜粪便、肠道内容物等样品中产气荚膜梭菌的分离和鉴定，主要用于细菌耐药性监测。
- 归口单位：全国兽药残留与耐药性控制专家委员会。
- 起草单位：中国农业大学、中国兽医药品监察所。
2. 规范性引用文件
包括GB 4789.13（食品安全标准）、GB/T 6682（实验室用水）、GB 19489（实验室生物安全）、NY/T 1948（兽医实验室生物安全）等。
3. 关键试剂与材料
- 培养基：Amies运送培养基、液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）、胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂（TSC）、5%绵羊血琼脂等（配制方法见附录A）。
- 标准菌株：产气荚膜梭菌毒素C型（CVCC 60101）。
- 其他试剂：PCR预混液、DNA提取试剂盒、α-氰-4-羟基肉硅酸（HCCA）等。
4. 仪器设备
- 核心设备：二级生物安全柜、厌氧培养装置、PCR仪、高速离心机、微生物质谱仪（MALDI-TOF MS）等。
5. 分离与鉴定流程
- 样品采集与运输：按NY/T 4141执行，确保无菌和低温保存。
- 预增菌：样品接种FTG培养基，36℃厌氧培养20-24小时。
- 增菌与分离：转接TSC琼脂，厌氧培养后挑取黑色单菌落。
- 纯化：在5%绵羊血琼脂上纯化，观察溶血环和菌落形态。
6. 鉴定方法
- 形态学检查：按GB 4789.13观察菌落特征（如溶血性）。
- 生化鉴定：使用生化试剂盒或微生物鉴定系统。
- PCR鉴定：
- 引物：靶向cpa基因（324 bp片段）。
- 条件：94℃预变性5分钟，30个循环扩增。
- 结果判定：电泳确认324 bp条带，测序相似度≥99%。
- 质谱鉴定：通过MALDI-TOF MS比对谱图，达到种水平可信度。
7. 菌株保藏
- 方法：甘油（20-40%）或磁珠保藏管冻存，-20℃以下保存。
- 保护剂：5%蔗糖脱脂乳（112℃灭菌）。
8. 生物安全要求
- 实验室需符合GB 19489和NY/T 1948，包括人员防护、废弃物处理等。
9. 附录内容
- 附录A：培养基详细配方（如Amies培养基含硫代乙醇酸钠）。
- 附录B：PCR电泳图示例及测序结果（324 bp目标片段）。
- 附录C：产气荚膜梭菌C型标准菌株的质谱谱图。
10. 其他说明
- 涉及专利时，发布机构不承担识别责任。
- 实验用水需符合GB/T 6682三级水标准。
该标准系统规范了从样品处理到鉴定确认的全流程，强调多方法（生化、PCR、质谱）互补验证，确保结果的准确性和可追溯性。
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