NY/T 4658-2025 动物源副猪嗜血杆菌分离与鉴定技术规程 ,该文件为pdf格式 ,请用户放心下载!
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资源简介
NY/T 4658-2025《动物源副猪嗜血杆菌分离与鉴定技术规程》主要内容总结
1. 标准概述
- 标准名称：动物源副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）分离与鉴定技术规程。
- 适用范围：适用于猪鼻腔拭子、肺脏、心包液、关节液等样品中副猪嗜血杆菌的分离与鉴定，主要用于细菌耐药性监测。
- 归口单位：全国兽药残留与耐药性控制专家委员会。
- 起草单位：华中农业大学、中国兽医药品监察所等多家机构。
2. 规范性引用文件
- 包括GB/T 6682（实验室用水）、GB 19489（生物安全）、GB/T 34750（副猪嗜血杆菌检测方法）、NY/T 4141（样品采集规程）等。
3. 关键试剂与材料
- 培养基：需添加NAD和胎牛血清的TSA/TSB培养基（配方见附录A）。
- 试剂：NAD溶液、TAE缓冲液、PCR预混液、甘油等。
- 标准菌株：副猪嗜血杆菌CVCC 3894等3株参考菌株。
- 仪器设备：生物安全柜、PCR仪、质谱仪（MALDI-TOF MS）、电泳系统等。
4. 分离与鉴定程序
流程图（图1）：
- 样品采集与运输：按NY/T 4141执行，使用Cary-Blair氏运送培养基保存。
- 分离纯化：
- 样品涂布/划线于含NAD和血清的TSA培养基，36℃培养24-48小时。
- 挑取针尖大小、灰白色半透明菌落纯化。
- 筛查：
- 形态学检查：显微镜观察菌体形态。
- 卫星现象试验：依赖NAD生长的特性验证。
- 鉴定方法（四选一）：
- 生化鉴定：按GB/T 34750或商用试剂盒。
- PCR鉴定：靶向16S rRNA基因（821 bp片段），需测序验证（相似度≥98%）。
- 荧光定量PCR：特异性引物扩增，Ct值≤29为阳性。
- 质谱鉴定：MALDI-TOF MS谱图比对，需达到种水平可信度。
5. 菌种保藏
- 方法：甘油（终浓度20-40%）、磁珠保藏管或冻干保护剂（5%蔗糖脱脂乳），-20℃以下保存。
6. 生物安全要求
- 实验室需符合GB 19489和NY/T 1948，包括设施、人员防护及废弃物处理。
7. 附录内容
- 附录A：培养基配制方法（如Cary-Blair运送培养基、TSA/TSB配方）。
- 附录B：PCR电泳图（821 bp条带）和测序结果示例。
- 附录C：荧光定量PCR扩增曲线图（Ct值判读标准）。
- 附录D：质谱鉴定谱图示例。
8. 其他要点
- 质量控制：实验需设阳性/阴性对照（如标准菌株和水）。
- 可疑结果处理：29<Ct≤32时需复核。
- 专利声明：标准可能涉及专利，发布机构不承担识别责任。
总结：该标准系统规定了副猪嗜血杆菌从采样到鉴定的全流程技术方法，强调多方法验证（生化、分子、质谱）和生物安全规范，为动物疫病监测提供标准化操作依据。
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